冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理ppt(实用资料).pptVIP

冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理;问题思考;一、冰冻切片的优缺点 ;二、切片制作过程中几个关键步骤;常规HE染色 特殊染色 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色，台盼蓝（肥大细胞）染色 免疫染色(immunol staining) 免疫荧光(immunol fluorescence) 免疫组化(immunol histochemistry) ;1. 动物取材：一定要注意“平行性”;（3）所有切片背景过深 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔 试剂公司提供标准化的试剂 试剂公司提供标准化的试剂 能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类 对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 三、 免疫组化结果分析 针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误 ④抗体温育的时间过长。 冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理 三、 免疫组化结果分析 含大量的脂肪 -30℃ 抗体效价急剧下降而失效 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等 缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 一、冰冻切片的优缺点;2. 标本固定应充分 ;减少冰晶的形成 ;3. 切片：组织新鲜非陈旧标本是成败首要因素;保持切片的完整性 ;防止切片卷缩 ;贴片中常见问题及处理 ;贴片方式及标记;4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关键环节;抗体分装和保存;替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替代第一抗体 Masson staining 3 I/R+treatment 优秀免疫组化切片: 信噪比高 （3）所有切片背景过深 抗体效价急剧下降而失效 ⑤H2O2 浓度过高，显色速度过快且粘 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 吸收实验：用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应 能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 试剂公司提供标准化的试剂;三、 免疫组化结果分析;1.实验分析的相关介绍;用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照 阴性对照还应包括 空白对照：用PBS替代第一抗体 替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替代第一抗体 吸收实验：用过量的已知相应的纯???抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应 抑制实验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的特异性抗体染色 ;;只有6，7实验结果有意义 1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义 必须重复实验或换用 Ab ;阳性染色特点 定位：胞浆、胞核、胞膜、间质有结构性 染色强度不同：颜色深浅不一 非特异性染色 细胞与组织无区别 弥散性均匀 ; 优秀免疫组化切片: 信噪比高;假阳性示范图;4. 染色失败的几种表现：;;①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。;冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理;问题思考;一、冰冻切片的优缺点 ;二、切片制作过程中几个关键步骤;常规HE染色 特殊染色 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色，台盼蓝（肥大细胞）染色 免疫染色(immunol staining) 免疫荧光(immunol fluorescence) 免疫组化(immunol histochemistry) ;1. 动物取材：一定要注意“平行性”;（3）所有切片背景过深 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔 试剂公司提供标准化的试剂 试剂公司提供标准化的试剂 能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类 对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 三、 免疫组化结果分析 针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误 ④抗体温育的时间过长。 冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理 三、 免疫组化结果分析 含大量的脂肪 -30℃ 抗体效价急剧下降而失效 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等 缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 一、冰冻切片的优缺点;2. 标本固定应充分 ;减少冰晶的形成 ;3. 切片：组织新鲜非陈旧标本是成败首要因素;保持切片的完整性 ;防止切片卷缩 ;贴片中常见问题及处理 ;贴片方式及标记;4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关键环节;抗体分装和保存;替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替代第一抗体 Masson staining 3 I/R+treatment 优秀免疫组化切片: 信噪比高 （3）所有切片背景过深 抗体效价急剧下降而失效 ⑤H2O2 浓度过高，显色速度过快且粘 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性