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热原检查法 中国鲎成为了国家二级保护动物，鲎试剂成为了紧俏资源。作为一个注射剂制药企业的QC，不得不考虑以后怎么来应对，除了采用减少鲎试剂的用量外，可选择重组鲎试剂或采用重组C因子法，但结果的等效性研究这个拦路虎很难打到。百无聊赖就翻开了《中国药典检测分析指南》2017年版的热原检查法，开卷有益，该版指南对人员检查的基本原理等进行了全面的阐述，现将学习内容进行总结。 1、热原相关的定义及来源 1.1 相关定义 热原是注射进入人体或动物体内后，能导致其体温升高的一类物质的总称。可以直接导致体温升高的物质称为外源性热原，由外源性热原引起体内产生的致热物质称为内源性热原。 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）。当细菌死亡或自溶后便会释放内毒素。 LPS是高分子量的脂多糖。 思考：以上定义解释了注射剂为什么要进行热原检查或细菌内毒素检查。 1.2 热原的致热原理 外源性物质进入人体，作用到单核细胞系统，刺激其分泌内源性致热原[主要有白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）干扰素（INF）及肿瘤坏死因子（TNF）等]；内源性致热原作用于下丘脑提问调节中枢，使体温调定点上调，造成产热增加、散热减少，导致人体发热。 思考：干扰素、抗肿瘤药物等是否会影响热原的检查？ 1.3 外源性热原的来源 1.3.1 外源性热原中微生物来源的包括： a) 革兰氏阳性菌细菌成分（脂阿拉伯甘露聚糖、蛋白、热休克蛋白A、脂磷壁酸等）； b) 革兰氏阴性菌细菌成分（脂质A、外膜蛋白、膜孔蛋白、陪伴蛋白等）； c) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞壁成分（细胞表面蛋白、菌毛、脂肽、脂蛋白、肽聚糖、胞壁酰二肽等）； d) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞外成分（毒素、超抗原等）； e) 非细胞性微生物（活病毒、真菌、酵母、疟原虫等）。 微生物产生的致热物质中，革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素致热性最强，其次是革兰氏阳性杆菌，革兰氏阳性球菌致热作用较弱，真菌、病毒致热作用更弱，因此，细菌内毒素被认为是自然界最强致热原。 思考： a) 注射剂中可能存在的外源性热原主要来自于革兰氏阴性菌死亡或自溶后释放的内毒素。 b) 其他微生物的污染仍需关注，特别是最终灭菌产品的注射液灭菌前负载高且存在较多革兰氏阳性杆菌污染时。 c) 热原检查法相对于细菌内毒素检查法仍有一定优势，单核细胞激活实验等新方法的开发也许会给热原检查法带来新的活力。 1.3.2 外源性热原中非微生物来源包括： a) 抗原（人血清白蛋白、球蛋白等）； b) 抗肿瘤药（博来霉素、阿糖胞苷等）； c) 其他（胆酸、多肽、多核苷、秋水仙碱等）。 思考：对于含有以上成分的产品使用热原检查法可能不适用。 1.4 内源性热原来源 a) 内源性热原中激素类包括：类固醇、前列腺素； b) 内源性热原中细胞因子类的包括：肿瘤坏死因子、干扰素、生长因子、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子等。 1.5 注射剂的热原来源 1.5.1 从溶媒中带入 如注射用水贮藏时间过久，被细菌污染后，细菌很快繁殖，短时间内可产生大量热原，虽然随后还有灭菌操作，但是已有热原存在，不易除去，且可能因为革兰氏阴性菌产生更多的内毒素，因而产生热原反应。我们需要对注射剂的溶媒进行细菌内毒素的检查，同时需要进行微生物限度检查。 1.5.2 从原辅料中带入 原辅料被热原污染的原因很多，如包装不符合要求或贮存日久，以及许多原辅料本身适于微生物生长。因此我们需要对注射剂的原辅料进行细菌内毒素的检查，同时需要进行微生物限度检查。注射剂一致性评价开展以后强调QBD理念，研发部门或企业进行注射剂仿制药研发时需要根据工艺确定原辅料的内毒素限值。 1.5.3 从用具或容器中带入 配制注射剂的装置、用具、管道及容器，如没有洗净或灭菌，都容易污染热原。故应按规定严格处理，并用无热原的注射用水反复冲洗合格后再用。对于这些设施设备的细菌内毒素的控制我们是通过清洁消毒等操作来完成的，为确保这些清洁消毒工作的有效性，我们需要进行清洁验证，在清洁验证过程中进行细菌内毒素检查。 1.5.4 在制备过程中污染 注射剂的整个制备过程要在规定的洁净环境中按既定的工艺进行，尽可能减少微生物污染的机会。为确认我们工艺对细菌内毒素控制的有效性，我们需要在工艺验证时对中间产品及成品进行细菌内毒素检查。 1.5.5 由于包装不严密产生热原 在制备注射剂时，如果包装材料未经严格挑选，如玻璃瓶底或颈间有微细的孔隙，瓶口边缘不完整，橡胶塞质量不好等，都可使注射液瓶有漏气现象而滋生细菌，产生热原；其次直接接触药品的内包材本身可能产生污染。对于直接接触药品的内包材我们需要进行细菌内毒素的检查，其次进行包装密封性的研究，此处不扩展。 1.5.6 从输液器中带入 有时注射剂本身虽不含热原，但注射后却有热原