flpfr位点特异性重组系统在植物转基因中的应用.docxVIP

flpfr位点特异性重组系统在植物转基因中的应用 以转移技术为代表的植物互补技术为农业的可持续发展提供了强有力的支持，但通过有效选择转移植物并选择合适的基因（如抗生素基因、添加剂基因等）的使用，增加了植物转世的安全性。因此,培育具有安全选择标记基因或无选择标记基因的转基因植物成为提高转基因植物安全性的有效手段。其策略之一是在转化植株筛选完成后,采取一系列措施将选择标记基因删除。 来自于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞核内2μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统中重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向frt位点间DNA片段的切除,其重组功能已在烟草、拟南芥、和水稻细胞、玉米细胞中得到验证,利用该系统可实现筛选完成后选择标记基因的删除。 植物基因启动子是重要的顺式作用元件,处于基因转录调控的中心环节。多数生物对外界环境温度升高最明显的反应是热激蛋白的表达,同时抑制体内原有的大部分mRNA和蛋白质的合成。由于热激蛋白启动子中热诱导元件和热激因子的保守性,热诱导蛋白启动子可被来自异源植物的热激因子所识别并调控其启动基因的表达。 本工作构建出可有效去除转基因植物中选择标记基因的FLP/frt位点特异性重组系统:含有frt位点的植物表达载体pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt和含有由热诱导启动子hsp启动的FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt。利用二次转化的方式将二者先后转入烟草植株,经热激处理后,重组酶FLP基因的表达可催化位于选择标记基因als两侧同向frt位点间的重组反应,从而有效去除选择标记基因als,产生无选择标记的转基因耐盐耐旱烟草植株。 1 材料和方法 1.1 质粒、试剂与仪器 烟草(Nicotiana tabacum) 品种Wisconsin 38。质粒p35S_als、pCAMBIA1300_betA_hpt、pCAMBIA1300_hsp_GUS_hpt由本实验室构建。质粒pROKⅡ、大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBA4404、啤酒酵母AS2399由本实验室保存。质粒pCAMBIA1300购自澳大利亚。各种DNA限制酶和DNA修饰酶及其相应缓冲液购自TaKaRa公司。载体pGEM_T_Easy Vector购自Promega公司。DIG标记试剂盒、DIG检测试剂盒及尼龙膜购自Roche公司。DNA片段玻璃奶回收试剂盒购自博大泰克公司。除草剂绿黄隆购自沈阳农药厂(有效浓度25%)。质粒重组中用到的各种DNA序列及转基因植株检测中用到的各种引物序列(如表1所示)由上海博亚公司合成。 1.2 植物表达载体的组成 1.2.1 质粒pcambi1300flp的构建 以啤酒酵母AS2399总DNA为模板,利用嵌套PCR方法克隆得到重组酶FLP基因编码区并连入pT_easy vector进行测序。第一步PCR反应使用引物FLP1、FLP4,程序为:预变性95℃ 5min;变性95℃ 1min,退火56℃ 1min,延伸72℃ 3min,循环30次;过度延伸7min。嵌套PCR反应使用引物FLP2、FLP3,程序为:预变性95℃ 5min;变性95℃ 1min,退火56℃ 1min,延伸72℃ 1.5min,循环30次;过度延伸7min。 用限制酶BamHⅠ和KpnⅠ从带有FLP基因的pGEM_T easy载体上切下测序正确的FLP基因全长编码区,同时质粒pROKⅡ也经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切,电泳分离后回收载体DNA,与FLP重组酶基因定向连接,重组得到含有FLP重组酶基因的植物表达载体pROKⅡ_FLP。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒pROKⅡ_FLP和pCAMBIA1300,分别回收带有nos终止子的FLP基因全长编码区和载体序列,将二者定向连接,重组得到质粒pCAMBIA1300_FLP_nos。最后,用BamHⅠ切质粒pCAMBIA1300_hsp_GUS_hpt和pCAMBIA1300_FLP_nos,分别回收hsp启动子和载体序列,将二者连接后鉴定正反向,得到含有由热诱导启动子hsp启动的重组酶FLP基因的植物表达载体pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt。 1.2.2 als基因片段的鉴定 合成的寡核苷酸单链frt1与frt2、frt3与frt4按照图1所示构建双链frt位点,然后将它们作为接头定向连接在用NcoⅠ和PstⅠ双酶切质粒p35S_als产生的选择标记基因als两端。 经测序,als基因片段两端带有正确的frt位点序列。将带有重组酶作用位点frt的als基因用XhoⅠ酶切后回收,同时质粒pCAMBIA1300_betA_hpt也用XhoⅠ酶切回收载体,将二者连接后鉴定正反向,构建得到选择标记