亚型sk2通道与肌浆网ryr2蛋白在小电导ca.docxVIP

亚型sk2通道与肌浆网ryr2蛋白在小电导ca 电导率ca2的激活通道k+（小电导率calius通道，sk）有四种不同的亚类型，即sk1、s2、s3和s4通道。人和小鼠的心肌组织存在SK 2通道,参与心肌细胞动作电位(actionpotential,AP)复极化的构成。SK通道是依赖于细胞内Ca2+激活的K+通道,其钙源主要来自细胞膜L-Ca2+通道,部分可能与肌浆网(ryanodine receptor,RyR),即Ca2+释放通道有关。作者之前的工作首次验证了心肌SK 2通道与RyR 2(心脏RyR型受体)为一功能复合体,具有相互作用。为进一步探讨SK 2的功能,作者采用酵母双杂交系统检测了SK 2蛋白与RyR 2蛋白之间是否存在直接相互作用,报道如下。 1 材料和方法 1.1 菌株和菌株 酵母菌株AH 109、酵母表达载体pGBKT7及pGADT7、酵母培养基YPD、缺陷型培养基SD/-Trp-Leu和SD/-Trp为Clontech公司产品;DH 5α大肠杆菌菌株为郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室保存;含有完整的小鼠RyR 2cD-NA质粒由Ray博士(加拿大卡尔加里大学)惠赠;含有完整的小鼠SK 2cDNA质粒购自OriGeneTechnologies公司。 1.2 分子质量和凝胶回收纯化试验 TaqDNA聚合酶、dNTP和质粒小量提取试剂盒购自Promega公司;EcoRⅠ内切酶、NdeⅠ内切酶、BamHⅠ内切酶、T4DNA连接酶和X-α-Gal购自TaKaRa公司;凝胶回收纯化试剂盒购自Axygen公司;常规分子生物学试剂为国产分析纯或进口分装。 1.3 ryr2蛋白结构域及引物的筛选 使用DNASTAR、DNASIS和VectorNTIAdvance等软件,并参考文献综合分析SK 2蛋白结构域,将SK 2分为3个片段,分别包含N-末端、C-末端和跨膜区。参阅文献综合分析RyR 2蛋白结构域,将RyR 2分成16个片段。根据GenBankSK 2基因(ID BC 125475)和RyR 2基因序列(ID NM 023868)分别设计引物,由上海博兴生物公司合成。采用PCR扩增、胶回收纯化RyR 2 16个目的基因片段和SK 2 3个目的基因片段,分别与T载体连接,形成重组子转化DH 5α,对筛选出的阳性克隆进行DNA测序分析。 1.4 重组ryr2基因片段与线性双黏pgadt7载体的关系 将3个SK 2双黏目的基因片段分别与线性双黏pGBKT7载体重组;将16个RyR 2双黏目的基因片段分别与线性双黏pGADT7载体重组。重组子pGBKT7-SK 2用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切鉴定,pGADT7-RyR 2用EcoRⅠ、BamHⅠ/NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。 1.5 感受态酵母细胞的培养 从YPDA平板上挑取AH 109单克隆,接入YPDA液体培养基,经重悬、洗涤及离心沉淀获得感受态酵母细胞。分别将pG-BKT7-SK 2和pGADT7-RyR 2电转化感受态酵母细胞AH 109,涂布X-α-Gal/SD/-Trp平板培养。蓝色菌落表明对酵母细胞有激活能力。 1.6 感受态酵母的诱导诱导酵母菌群落生长 将3个酵母表达载体pG-BKT7-SK 2分别与16个表达载体pGADT7-RyR 2进行组合,两两配对(共48对),采用山梨醇电转化法将48个配对分别转化入感受态酵母AH 109,点于X-α-Gal/3-AT/SD/-Trp-Leu固体培养基,30℃倒置培养3d。同时以含有pGBKT7-53/pGADT7-T的酵母菌AH 109点种作为对照。若上述转化酵母菌落生长且变蓝,说明转化子之间有相互作用;若为白色菌落生长,说明两转化子转入核内,但无相互作用。 2 结果 2.1 阳性克隆测序 经PCR扩增,获得3个SK 2目的基因片段,分别为411、729和546bp。将3个目的基因分别克隆至T载体,转化E.coliDH 5α,筛选出的阳性克隆测序结果与GenBank中报道的SK 2序列一致。3个重组子与pGBKT7连接,经酶切鉴定,得到重组酵母表达载体pGBKT7-SK 2441、pGBKT7-SK 2729和pGBKT7-SK 2546(图1)。 2.2 表达阳性克隆 经PCR扩增,获得16个RyR 2目的基因片段:1 159、1 166、1 186、1 203、1 062、814、1 235、1 693、1 070、1 104、1 049、662、870、1 006、845和684bp。分别将16个RyR 2目的基因片段亚克隆至T载体,转化E.coliDH 5α,经酶切筛选阳性克隆测序,结果与GenBank报道的RyR 2序列完全一致。将16个重组子RyR 2-T所含的目的基因片段分别克隆到pGADT