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谷胱甘肽清除自由基的研究 1 谷胱甘肽抗氧化的作用机理 谷胱甘醇是生物通过氧化反应保护系统中最重要的低分子活性活性物质。分为氧化谷胱甘醇（gssg）和还原谷胱甘醇（gsh）。GSH作为谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx) 或谷胱甘肽转移酶 (GSH s-transferase) 的作用底物, 可清除生物体内有害自由基 (主要是氧自由基) 或脂质过氧化物, 使其转换成脂肪酸和水, 而GSH被氧化成GSSG(见图解1) 。 在酶的调控下, 生物体内GSH和GSSG通常处于稳恒性动态平衡, 即当机体内由于GSH的清除自由基作用导致积累较多的GSSG时, GSH还原酶将作用底物GSSG还原成GSH。这种稳恒性动态平衡的重要标志是GSH/GSSG比值约为100∶1。 当机体受到严重的氧化胁迫时, GSSG 还原成GSH的过程受阻, 大量的GSSG积累在细胞液中, 并破坏氧化还原动态平衡, 给生物体带来不良影响。图解1所示的抗氧化模式中, GSH是通过电子和质子的传递作用来清除自由基, 而GSSG本身无清除自由基作用, 只参与维持两种形态谷胱甘肽的动态平衡。在该生化反应体系中, GSSG除了作为GSH还原酶底物维持谷胱甘肽的稳恒性动态平衡之外, 还可能参与其它生化反应。文献报道胱氨酸残基中的二硫键在生物体内参与许多氧化还原反应和自由基反应并生成各种硫氧化物。研究非酶条件下的氧化型谷胱甘肽在谷胱甘肽抗氧化系统中的作用和相关的化学反应, 对进一步了解谷胱甘肽的生物学功能具有重要意义。本研究考察了GSH 和不同配比的GSSG和Na2SeO3混合溶液对DPPH自由基的清除能力, 探讨了GSSG和Na2SeO3对GSH的协同抗氧化作用。根据自由基清除率和质谱测定结果, 提出了GSSG和Na2SeO3对GSH自由基清除过程中的协同机理。 2 实验部分 2.1 质谱仪 UV-8500紫外/可见分光光度计 (天美公司) ;MALDMA-CFR (日本岛津公司) ;激光解吸电离飞行时间质谱仪 (N2激光器, 激光波长为337 nm) 。 1, 1-二苯基-2-苦肼 (DPPH) 、还原型谷胱甘肽 (GSH) 、氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 、Na2SeO3、α-氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA) 及三氟乙酸购自Sigma公司。DPPH用无水乙醇配制, 谷胱甘肽用三次蒸馏水配制。 2.2 dpph自由基清除率的测定 体外检测清除自由基的方法以清除DPPH自由基为最常见。参照文献, 采用分光光度法, 通过测定DPPH自由基与GSH作用前后最大吸收波长 (517 nm) 处吸收光谱, 用多项式回归拟合的方法得到作用前后的吸光度变化值 (ΔA517) 与GSH浓度的多项式拟合回归方程, 并根据回归方程计算出不同浓度的GSH和DPPH混合溶液的自由基半数清除率 (IC50) 。 3 结果与讨论 3.1 gsh的自由基清除率及与na2seo3的比例关系 图1为DPPH乙醇溶液和在该溶液中加入适量GSH、GSSG和Na2SeO3混合溶液后的吸收光谱图。DPPH在517nm处有最大吸收。当加入与DPPH等量的GSH时, 此波长处的吸光度 (A517) 从1.33降低到0.55 (图1A曲线2) , 说明GSH具有明显的清除DPPH自由基的能力。图1B中曲线2和3分别为GSH 和GSSG量比 (GSH∶GSSG) 为10∶1和100∶1时的吸收光谱图, 其吸光度分别为0.79 和0.48, 说明GSH/GSSG 比率为100∶1时具有更高的自由基清除率。与图1A的结果比较, 当GSH/GSSG 比率为100∶1时, 比等量的纯还原型谷胱甘肽 (GSH) 的吸光度降低更明显, 说明尽管认为氧化型GSSG无清除自由基能力, 但适量GSSG的存在会提高GSH的自由基清除能力。当固定GSH浓度为0.10 mmol/L, 加入不同浓度的Na2SeO3(见图1C中曲线2和3) 时, DPPH在517 nm处的吸光度随GSH 和Na2SeO3的相对量比的增加而增加, 说明在恒定的GSH浓度下, 其自由基清除率随Na2SeO3加入浓度的减小而增加。当固定GSH/GSSG比率为100∶1, 加入不同浓度的Na2SeO3的浓度 (见图1D中曲线2和3) 时, DPPH在517 nm处的吸光度随Na2SeO3加入浓度的增加而减小, 说明自由基清除率随Na2SeO3的浓度增大而减小。 为考察GSH浓度、GSSG和Na2SeO3对GSH的清除DPPH自由基能力的影响, 在固定DPPH浓度 (0.10 mmol/L) 情况下, 分别测定了一系列不同浓度的GSH和不同配比的GSH、GSSG和Na2SeO3混合溶液在517 nm处的吸光度变化值ΔA517=ADPPH-AGSH混合液。结果发现, ΔA517值随