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分子生物学 添加时间：2008.10.29 | 作者：admin 实验一 仪器介绍和实验规范训练及实验准备 一、实验目的 1. 系统回顾分子生物学实验技术的发展。 2. 了解分子生物学——特别是关于分子克隆的实验方法和理论、了解分子生物学实验安全规则和注意事 项。 3. 掌握分子生物学实验所用试剂的配制过程。 二、实验内容 1. 分子生物学实验的条件与设施 , 包括各种仪器设备、房屋设置等； 2. 分子克隆的常规实验方法和理论； 3. 分子生物学实验安全规则和注意事项； 4. 配制近期实验所需要的公共试剂。 三、实验所需仪器设备 1. 多媒体设备 2. 实验所需仪器 37℃ 培养箱、温控空气摇床、温控水浴摇床、超净工作台( 双人双面)、电子天平、双蒸水器、高压锅、 磁力搅拌器、移液枪、振荡器、-20℃冰箱、制冰机、 -70℃冰箱、高温烘箱、离心管、枪头、烧杯、量筒 等。 3. 实验药品 氯化钠、氢氧化钠、 Tris 碱、琼脂糖、盐酸、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、SDS 、 EDTA 、无水 乙醇、 95% 乙醇、低熔点琼脂糖。 四、注意事项 1. 高压蒸气灭菌 （1）紧盖和开盖时，都应采用对角式均匀地转动紧固螺栓，并且双手同时 操作。切不可采用将紧固螺栓逐个拧紧或松开的方法。 （2 ）灭菌结束以后，切勿过早打开排气阀，否则，开盖时试管内的培养基 会由于内外压力不平衡而冲出管口，使棉塞上沾染培养基而发生污染。 2. 紫外线防护 在操作紫外装置时，注意自我防护，避免直接接触紫外线，以防灼伤皮肤或眼睛。 实验二 家蚕基因组DNA 提取及检测 一、实验目的 1. 了解并掌握苯酚法提取动物基因组 DNA 的原理和步骤。 2. 了解DNA 浓度和质量测定的技术。 二、实验原理 酚、氯仿是蛋白质变性剂，能有效出去核蛋白，使核酸从核蛋白复合体中分离出来。氯仿还能加速有机相 与液相的分层，少许异戊醇能稳定界面，减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。 三、实验材料、试剂和设备 1. 实验材料和试剂 材料：家蚕蛹 试剂：液氮、平衡酚（Tris 饱和）、1 mol/L Tris-HCl （pH8.0 ）、0.5 mol/L EDTA （pH 8.0 ）、TE （P H8.0）、10mol/L CH COONH 、70%乙醇、20mg/ml Proteinase K、10mg/ml RNA 酶。 3 4 抽提缓冲液： 10 m mol/L Tris-Cl （pH8.0 ） 0.1 mol/L EDTA （pH 8.0 ） 0.5% SDS 加样缓冲液： 0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯青 （FF）； 15%聚蔗糖水溶液 2. 实验仪器 冷冻离心机、常温离心机、电泳仪、核酸电泳槽、核酸蛋白定量仪、37℃培养箱、温控水浴摇床等。 四、操作步骤 1. 将家蚕蛹放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉末状；加入1mL 的抽提缓冲液，轻轻摇匀，形 成匀浆状，将匀浆液转至5mL 无菌离心管中；再用1mL 的抽提缓冲液清洗研钵，并将洗液转入同样的离 心管中，然后加入蛋白酶K 至终浓度100μg/mL，52℃水浴保温5h 或过夜； 2. 加入等体积平衡酚，温和振荡，摇匀15 min （置-20℃，5-10 min）；4℃ 12000 rpm 离心10 min， 将粘稠的上清液转移到离心管中； 3. 再用酚﹕氯仿（1 ﹕1），氯仿各抽提一次10 min，然后4℃12000rpm 离心10 min； 4. 移出上层水相，加入2-2.5 体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA 立即形成沉淀；4℃，70 00 rpm 离心10 min 或用高压灭菌过的玻璃棒/消毒牙签将DNA 沉淀从乙醇溶液中移出； 5. 用70%的乙醇洗涤DNA 沉淀2 次，晾干后，加入350 μL TE （pH8.0 ），并加入RNAase 使终浓度为 50 μg/mL，在37℃培育4h ； 6. 将DNA 转移到1.5mL 的无菌离心管中，再加入TE （pH 8.0 ）350 μL 到5mL 无菌离心管中洗涤，并 将洗液转入同样的 1.5mL 离心