大肠杆菌刺激蝇蛆产生抗菌肽浓度和抑菌活性的测定.docxVIP

大肠杆菌刺激蝇蛆产生抗菌肽浓度和抑菌活性的测定武玉飞浏海燕;高明明;周钢;王俊刚伸红【摘要】［目的］确定大肠杆菌菌液刺激蝇蛆产生浓度高、活性强的抗菌肽时间和蝇蛆饲喂家禽的安全性.［方法］采用不同浓度的大肠杆菌菌液分别与麸皮混合饲喂蝇蛆,于10、24、48h分别收集存活蝇蛆并对其粗提取抗菌肽，通过考马斯亮蓝法和抑菌试验分别测定各试验组抗菌肽粗提液的浓度和抑菌力，同时用CFU计数法测定细菌培养的家蝇幼虫的细菌含量以确定其作为绿色抗生素的安全性.［结果］浓度为3.0x107cfu/ml的大肠杆菌作用24h的蝇蛆组产生的抗菌肽浓度最高、活性最强,且蝇蛆体内细菌含量为1.6x105cfu/g,低于国家规定的饲料细菌标准含量最低值(2x106cfu/g).［结论］为进一步利用动物死尸、畜禽粪便生物转化蝇蛆产生大量安全、浓度高且活性强的蝇蛆抗菌肽作为绿色抗生素运用于禽类养殖业奠定了基础. 【期刊名称】《安徽农业科学》【年(勤期】2013(000)007【总页数】3页(P2976-2977,2984)【关键词】蝇蛆；大肠杆菌;抗菌肽;浓度抑菌活性【作者】武玉飞浏海燕;高明明;周钢;王俊刚伸红【作者单位】石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003 【正文语种】中文【中图分类】S852.61+2畜禽养殖业的快速发展致使一些传染病或疫病频繁出现。目前，畜禽规模化养殖的疾病防治主要采用预防接种和抗生素治疗的方法。疫苗有灭活苗和弱毒活苗，其中灭活苗免疫效果相对较弱，弱毒苗有毒力强的危险。抗生素对预防和控制动物疾病有一定效果，但由于生产实践中抗生素的大量使用，使得一些致病细菌产生了耐药性，给治疗该病造成了一定困难［1］。此外，药物残留也对禽类产品的安全性构成威胁。 抗菌肽又称抗微生物多肽，是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽。在药理学上，抗菌肽具有良好的耐高温耐酸碱性、广谱高效抗菌性且对真菌、病毒、寄生虫、癌细胞都有一定的抑制和杀灭作用［2-4］作为饲料添加剂，抗菌肽不仅可提高畜禽机体免疫力，防治畜禽疾病，而且对畜禽具有良好的促生长作用［5］。一般自然条件下，家蝇幼虫即蝇蛆中的抗菌肽表达量较低。目前，有关产生高含量蝇蛆抗菌肽的研究方法，国内外卜学者普遍采用微生物感染或理化因素等刺激蝇蛆增加其表达量。其中，采用带菌针刺损伤体壁的方法诱导家蝇幼虫产生抗菌肽，在实际操作过程中费时，易造成家蝇幼虫死亡，不利于抗菌肽的收集;用超声波等方法虽然简单，但成本高。而利用菌液刺激培养蝇蛆产生抗菌肽的方法操作简单，易推广使用。据报道，外界刺激蝇蛆产生抗菌肽的浓度、活性与诱导时间呈—定相关性［6］。鉴于此，笔者采用混有一定浓度大肠杆菌的麸皮饲喂3日龄蝇蛆来探究抗菌肽浓度、活性与时间的相关性，以期为进一步利用动物死尸、畜禽粪便生物转化蝇蛆产生大量安全、浓度高且活性强的蝇蛆抗菌肽作为绿色抗生素运用于禽类养殖业奠定基础。 1.1材料1.1.1试虫。蝇蛆由石河子大学农学院昆虫实验室提供。 1.1.2菌株。大肠杆菌由石河子大学动物科技学院微生物实验室提供。 1.1.3试剂。胰蛋白腺、酵母提取物、氯化钠、乙酸铵(分析纯)、冰乙酸、2%。蔬基乙醇、考马斯亮蓝G-250、95%乙醇、85%磷酸、标准蛋白质溶液(用结晶牛血清白蛋白用纯化水配制而成，浓度为100pg/ml)均购于石河子大学设备科。 1.2方法1.2.1试验设计。挑选大小相似的3日龄蝇蛆300只，将其平均分为6组。用比浊法测定大肠杆菌培养液的生长浊度，用生理盐水将培养好的大肠杆菌菌液浓度稀释为0.75x107、1.50x107、3.00x107cfu/mlo将一定量各浓度菌液和蒸馏水分别与同等质量的麸皮混合于敞口塑料瓶中，在适宜的恒温恒湿箱中培养蝇蛆。具体饲喂过程见表1。 1.2.2蝇蛆体内抗菌肽粗提取。蝇蛆饲养一定时间后，分别将各组存活蝇蛆用自来水反复冲洗8~10次，再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸将蛆体蘸干［7］。然后，将—定量虫体放入高速组织捣碎机中，按m虫体(mg)：V提取液(ml)=1：3的量加入提取液［0.05mol/L乙酸铵缓冲液，pH5,0.35pg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF),2%。蔬基乙醇］，充分捣碎，匀浆，然后12000r/min高速冷冻离心30min,取上清液重复3次，合并上清液并于沸水浴中搅拌加热5min，迅速冷却后，4800r/min离心30min，取上清液(抗菌肽粗提液)置于-20°C冰箱保存［6］。 1.2.3蝇蛆抗菌肽浓度测定。用考马斯亮蓝法(Br