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利用双水平法制备乌梅低聚肽的研究 genwall是中国的一种独特鸡，含有丰富的营养成分，是高质量蛋白质的来源。通过酶解制得乌鸡低聚肽, 能够释放出乌鸡蛋白质中的活性肽段。低聚肽具有吸收快、耗能低、易于被人体消化和吸收等特点, 对乌鸡的开发利用具有重要的意义。但乌鸡低聚肽作为食品原料, 加工条件是否影响其稳定性目前尚不明确。因此, 本文以乌鸡为原料制备乌鸡低聚肽, 在对其基础理化成分进行分析的基础上, 以分子量分布为指标, 研究温度、pH值和蛋白酶消化对乌鸡低聚肽稳定性的影响, 以期为其在食品工业中的应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料和机器 1.1.1 白酶、盐酸、碱 乌鸡:市售;碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶:诺维信生物技术有限公司;盐酸、氢氧化钠:北京化工厂, 分析纯;乙腈:美国Fisher公司, 色谱纯;三氟乙酸:英国Alfa Aesar公司, 分析纯。 1.1.2 喷雾干燥机 TJ12-H绞肉机:广东恒联食品机械有限公司;RJT03匀浆机:北京市和莫机电研究所;YG30喷雾干燥机:无锡市阳光干燥设备厂;FE20K型pH计:瑞士梅特勒-托利多公司;HH-4数显恒温水浴锅:普瑞斯机械有限公司;LC-20AD型高效液相色谱仪、凝胶色谱柱 (TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm) :日本岛津公司。 1.2 方法 1.2.1 果汁酶解果汁alcarlog的制备 将乌鸡除去内脏后, 用水洗净, 切块后称取2 kg, 用绞肉机绞碎, 分多次加适量水用匀浆机匀浆。转移到酶解罐中, 用蒸馏水定容至6 L。用NaOH溶液调节pH值为8.5, 升温恒定至60℃后, 以每克蛋白质3000单位的酶量加入Alcalase 2.4 L, 酶解2 h。之后调节pH值为7.0, 温度为60℃, 以每克蛋白质2500单位的酶量加入木瓜蛋白酶, 酶解2 h。酶解结束后, 升温至100℃, 保持10 min, 灭酶。冷却后6000 r/min离心15 min, 取上清液。用截留分子量为2×106u的陶瓷膜过滤2～3 h, 以虹吸方法吸出中间清液, 弃去上层油脂。然后用截留分子量为1000 u的超滤膜超滤, 得到分子量小于1000 u的滤过液, 将滤过液喷雾干燥, 进口温度220℃, 出口温度200℃, 转速40 r/min, 得到乌鸡低聚肽干粉。 1.2.2 水分含量、灰分含量、脂肪含量测定 蛋白质含量测定采用GB/T 5009.5规定方法, 水分含量测定采用GB/T 5009.3规定的方法, 灰分含量测定采用GB/T 5009.4规定的方法, 脂肪含量测定采用GB/T5009.6规定的方法。 1.2.3 检测波长和流速 将样品经孔径0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后, 用高效液相色谱仪进行凝胶过滤。流动相:乙腈:水:三氟乙酸, 45:55:0.1 (v/v/v) ;检测波长:220 nm;进样体积:10μL;流速:0.5 mL/min;柱温:30℃, 利用紫外检测器检测, 使用GPC软件处理数据。5种肽标准品为乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸 (分子量189) 、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸 (分子量451) 、杆菌酶 (分子量1450) 、抑肽酶 (分子量6500) 、细胞色素C (分子量12500) , 配制成0.1% (m/v) 溶液, 过膜后进样, 用来制作相对分子量校正曲线。 1.2.4 水浴温度和时间 用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉, 配制成浓度为2 mg/mL的溶液, 分装至5支50mL离心管, 置于水浴锅中, 分别在20、40、60、80、100℃下水浴, 2 h后冷却至室温, 分别检测其分子量分布。 1.2.5 ph对离心系数的影响 用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉, 配制成浓度为2 mg/mL的溶液, 分装至5支50 mL离心管中, 分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节各管pH为2、4、6、8、10, 在37℃的水浴锅中放置2 h, 冷却至室温后分别检测其分子量分布。 1.2.6 外部模拟对胃肠胃的消化实验 1.2.6. 消化前对照处理 用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉, 配制成浓度为2 mg/mL的溶液, 将40mL溶液置于50 mL离心管中, 用1 mol/L HCl调节pH为2, 在37℃的水浴锅中预热片刻, 加入3% (E/S) 胃蛋白酶, 混匀后迅速取出样品20 mL于另外1支50 mL离心管, 沸水中灭酶活10 min, 以此作为样品消化前对照。取出后, 将剩余20 mL样品置于37℃水浴锅中消化3 h, 沸水中灭酶活10 min, 冷却至室温后分别检测消化前后的样品分子量分布。 1.2.6. 样品的消化 用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉, 配制成浓度为2 mg/mL的溶液, 将40