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PAGE PAGE 4 酶工程实验报告 指导老师： 学号： 姓名： 班级： 生物技术班 **师范大学生命科学学院07级 2010-1 生物工程实验指导（酶工程部分） 实验一 木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测 一、概述 以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。 木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。 木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。最适温度65℃，易变性失活。木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。 二、实验目的 1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。 2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。 三、能力培养目标 1、蛋白质分离纯化的工艺流程，特别是盐析操作技术的熟练掌握； 2、酶活力检测方法的掌握。 四、实验难点 采用盐析分离纯化技术制备酶类产品时如何保证酶活力的同时提高酶产品的得率。 五、实验方式、方法建议 1、集中式训练：学生在老师的讲解和指导下按如下步骤操作训练； 2、启发和探索式：老师提供木瓜蛋白酶的理化、生物学特性、相关分离纯化技术和工艺，让学生查阅资料，然后在下面生产工艺基础上进行一些工艺和操作参数的试验，比如在（NH4)2SO4分级分离后采用层析分离或透析，试验层析或透析操作参数和比较集中工艺的优劣，以培养学生灵活运用分离纯化技术的能力。 六、实验原辅材料和仪器设备 1．原辅材料 （1）木瓜乳汁的采集及采后处理? 在清晨或中午下雨后，选择2.5～3月龄已充分长大的青木瓜，用锋利刀片在未成熟的青果表面纵割3～4条线，下刀深度在2mm深以内，环绕茎干装一倒伞型收集盘，接收流下的乳汁。割后30～60s乳汁停止流出，把粘在果上的乳汁赶入收集盘。用浸过硫酸钙或杀菌剂溶液的洁净布擦果，防切口感染。 （2）硅藻土和河沙：硅藻土选用化学纯试剂，河沙经清洗、浮选、烘干后过60～80目筛。 （3）半胱氨酸、（NH4)2SO4和NaCl均选用化学纯试剂。 （4）酶稀释液：半胱氨酸0.03mol/L（0.1537g）、EDTA.2Na0.00603mol/L（0.0935g），两者分开用适量蒸馏水溶解，再将EDTA.2Na溶液倒入半胱氨酸溶液中，使其溶解，调节至pH 4.5，定容至25ml。 （5）酪蛋白溶液(底物)：称磷酸氢二钠1.447g加蒸馏水约80ml，溶解后加入0.80g酪蛋白，水浴上加热搅拌溶解，待完全溶解后，冷至室温，调pH至7.0，定容至100ml，摇匀。 （6）TCA溶液(变性剂)：称三氯醋酸(TCA)2.247g，乙酸钠1.824g，冰醋酸2g，定容至l00ml。 （7）酪氨酸标准液(50μg/ml)：称105℃烘至恒重的酪氨酸5.0㎎，用0.1 mol/L HCl定容至100ml。 2．主要仪器设备：研钵、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅。 七、训练内容和步骤 1、木瓜蛋白酶的分离纯化（下午组数据） (1)粗提：木瓜乳汁100g(实验中28.8g)、硅藻土50g(14g)和筛选过的砂子75g(21.8g)混匀，在室温下加100ml-150ml（50ml）半胱氨酸溶液(0.04mol/L，pH5.7)，，在研钵中充分磨匀，静置后倾出上清液，再用150ml（50ml）半胱氨酸溶液重复研磨和洗提，然后用半