二代测序NGS实验方法和应用.docxVIP

这里为您介绍二代测序的有关流程和应用。 随着人类基因组工程的完毕，对于低耗费的测序技术的需求增进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序，含有广泛的应用： 全基因组从头测序或者重测序 目的序列重测序 转录组分析 微生物组研究 基因调控研究 NGS序列 二代测序仪器有诸多个组合，在通量、片段长度、精确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差别。? 从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范畴，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。 台式测序仪使得任何实验室都能够像使用real-timePCR同样，自己进行测序。这些仪器能够和某些靶标序列富集技术相结合，用在某些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（例如癌症样本）中的突变。现在，这些仪器的通量在10Mb到7.5Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。 高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范畴的研究，每次测序能测定600Gb的序列。某些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反，也有某些仪器能测序的片段较长（达成2500bp），但是其精度和测序能力（90Mb）要低诸多。尚有某些测序能力位于两者之间的仪器（~800bp，700Mb）。 因此，应用决定了哪一种仪器是最适宜的。 有一种新的办法被称作“纳米孔测序”。这种技术中，根据一种DNA链通过一种合成的或者蛋白纳米孔道所引发的电流的变化，能够拟定通过这个孔道的碱基。这理论上能够仅用一步就测序一种完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。 DNA测序 二代DNA测序的工作流程以下： DNA样本制备 文库构建和验证 文库分子大规模平行克隆扩增 测序 二代测序DNA样本的质量控制 首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。 凝胶电泳法 基因组DNA的完整性和大小，能够用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳的精确度不高，这是由于大的DNA分子在凝胶中移动的时候，本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。但是，它仍然能够提供完整性（大小范畴）和纯度（RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。因此，它仍然是评价基因组DNA质量的有效办法之一。 注：RNA污染会造成DNA浓度高估，并且克制某些下游环节。如果能必定有RNA污染，则可使用去DNase的RNaseI解决样本。 分光光度测定法 分光光度仪在260nm和280nm处读数的比例（A260/A280）能够用来预计DNA相对于某些吸取紫外光的杂质（例如蛋白）的纯度。纯净的DNA的A260/A280比例大概为1.7–1.9。 注：想要获得精确的A260/A280值，需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(例如,10mMTris?Cl,pH7.5)。 第二个环节是测定基因组DNA的浓度。 分光光度法 DNA的浓度能够通过使用分光光度仪测定其在260nm波长的吸光度来拟定。Nanodrop现在被广泛使用，由于它需要的样本量少(1μl)，并且使用方便（不需要比色皿）。为了确保成果的可靠性，读数应当在0.1到1.0之间。? 注：吸光度测定不能区别DNA和RNA。RNA污染物会造成DNA浓度高估。但是，纯净RNA的A260/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大概为1.8。因此，如果这个值为1.95，那么阐明样本里面有RNA杂质。 注：苯酚在270–275nm的波长范畴内有最大的吸光度，非常靠近于DNA。因此苯酚能提高样本在260nm附近的吸光度，从而造成高估DNA的产量和纯度。 荧光法 荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，含有特异性和敏捷性。Hoechst33258结合到DNA上后，能增大458nm波长附近的发光强度，除此之外，也能够使用某些更加敏捷的荧光染料，例如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法敏捷10，000倍，而比使用Hoechst33258染料的办法最少敏捷400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA和单链DNA。 DNA原则品和样本与荧光染料混合，并且使用荧光计检测。将样本的测定成果与原则品的测定成果相比较，以拟定DNA的浓度。 Real-timePCR? 能够使用real-timePCR技术来测定DNA样本的数量和质量。多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段，是检测DNA损伤和片段化的有效质控手段。这类技术实验专门测定可经PCR扩增，适于二代测序的DNA分子。上述提到的这些常规办法，普通不能测定的样本中扩增得到的DNA的量，