实验报告 小麦种子储藏蛋白.doc

PAGE PAGE 3 实验二 小麦种子储藏蛋白─HMW-GS的分离(SDS) 一、实验目的 利用SDS─聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)研究小麦种子储藏蛋白，高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成结构。此外SDS也是测量蛋白质亚基分子质量常用的方法。通过本实验，掌握SDS的基本原理、技术以及应用。 二、实验原理 用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（巯基乙醇或二硫苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使蛋白质亚基带上大量负电荷，从而掩盖了蛋白质各亚基原有的电荷差异。亚基的构象均呈长椭圆棒状，各各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中迁移速度仅与亚基分子质量有关。因此，SDS可用来分离蛋白质亚基并测定其蛋白质亚基的分子质量。 三、材料与仪器 1、仪器 电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、脱色摇床、加样枪、50ml烧杯2个、移液管。 2、试剂和材料 70%乙醇、50%正乙醇、样品提取缓冲液、样品提取液、30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED、电极缓冲液、染色液、漂洗液。 四、实验步骤 1、样品的提取 [1] 分别取4粒小麦种子研碎，加入70%乙醇1000ul，10min后，1200转离心8min，弃乙醇晾干。 [2] 加50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ul混匀后，50℃水浴1.5h，中途振荡，1200转离心8min。 [3] 取上清液加满丙酮置于-20℃中3h。 [4] 1200转离心8min，倒掉丙酮晾干，加样品提取液250ul、待溶解完全后，煮沸3分钟，取上清液点样。 2、SDS分析 [1] 组装电泳槽（略）。 [2] 凝胶制备 取两只50ml干净的烧杯，按下表1加样。在组装好的电泳槽中先制备分离胶，待分离胶聚合后，倒掉乙醇容易，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静止聚合。 表1 凝胶制备试剂配方 聚丙烯酰胺凝胶配方 分离胶 浓缩胶 30%Acr-Bis(ul) 2.5 0.62 pH8.8Tris-Hcl(ul) 2 ─ pH6.8Tris-Hcl(ul) ─ 1.3 H2O(ul) 2.95 3.0 1%AP(ml) 100 75 [3] 加样及电泳 待凝胶完全聚合后，拔掉电泳梳子。然后将电泳槽注满电极缓冲液。取适量上清液加样。为了比较蛋白质条带的效果，将4个小麦品种的样品，分别按照2.5ul和5ul两种不同剂量加入。此外，电泳装置上接负极，下接正极，恒流20mA，待溴酚蓝走出分离胶30min后停止电泳，取出玻璃板，剥胶染色。 [4] 染色 剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液，盖上盖子，放入微波炉中低温染色3min，每隔一分钟取出振荡。 [5] 脱色 将染色液倒回瓶内，加入漂洗液至背景无色为止，照相保存。 五、结果与分析 本次实验没有加入标准蛋白质，无法计算相对迁移率。实验结果见下图。 样4 样3 样2 样1 样4 样3 样2 样1 从上图可以看出，样品1储藏蛋白含有3个亚基，样品2、3、4的储藏蛋白有4个亚基。亚基分子质量在凝胶图片上的排列方向为从上至下依次递减。至于此储藏蛋白分子亚基分子质量和它的亚基种类等性质，需进一步研究方能解决。 凝胶下部底部有很多蓝色条带，此为其他小分子物质，表明储藏蛋白的提取不干净，含杂质太多；8条带不在同一水平线上，是因为凝胶加样不均匀，以及电泳装置本身问题；此外实验存在部分窜样现象，原因在于加样后没有及时电泳。另外，加样的多少对结果影响不明显，但加样不宜过多或过少。