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PAGE PAGE 2 医学微生物学实验设计论文 论文题目：手足口病毒的分离与鉴定 指导老师： 吕锐、于红 班 级：2010级临床2、3班 2012年6月2日 研究内容摘要 实验目的：通过进行实验，分离出引起手足口病的病毒并且鉴别病毒种类。 实验方法： 1.标本的采集。 2.分别取疱液、咽拭子、粪便标本悬液接种RD细胞、Vero细胞，进行病毒的分离。 3.通过细胞超微结构及病毒颗粒的电镜检测、聚合酶链反应(PCR)扩增病毒核酸、蛋白质免疫印记杂交检测蛋白表达量、MTT法检测病毒对细胞的生长抑制进行病毒分离株的鉴定。 实验结果：分离出的病毒为CA16和EV71。 关键词 手足口病；肠道病毒；病毒的分离与鉴定。 一、选题的目的和意义 手足口病是一种儿童传染病，又名发疹性水疱性口腔炎。多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹。患者感染后，多以发热起病。口腔粘膜出现散状疱疹，米粒大小，疼痛明显；手掌或脚掌部出现米粒大小疱疹，臀部可受累。疱疹周围有炎性红晕，疱内液体较少。大多数患儿在一周以内体温下降、皮疹消退，病情恢复。但是，重型患者病情进展迅速，在发病1-5天左右出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，也有少数病例病情危重，可致死亡，存活病例留有后遗症。近年来，手足口病在我国出现过几次大规模的流行，并且导致近百名儿童死亡。 手足口病是一种我国常见的流行病，但是手足口病目前没有有效药物治疗，也没有疫苗可以进行预防。通过对手足口病病毒的分离与鉴定，可以明确引起手足口病的病毒学类型，进而对病毒进行核酸、蛋白质研究。实验可知，EV71病毒可以引起儿童的手足口病，则我们可以在已获得部分毒株序列的基础上，进一步开展血清和分子流行病学调查，完善对病毒流行规律、流行特点和基因分型的认识，由此阐明EV71不同毒株之间的进化关系，进而研究不同毒株对手足口病的不同致病机制，从而研制出有效控制手足口病的疫苗，如亚单位疫苗，基因工程疫苗，减毒活疫苗等。另外，研究病毒的生物学性状也有利于手足口病治疗药物的研制。 我们进行这项实验，目的就在于希望弄清楚引起手足口病毒的性状，为今后研制治疗药物及其疫苗提供理论支持。 二、国内研究现状 相关研究进展与现况： 1）肠道病毒71型是一种具有较强致病性的肠道杆菌，主要引起患者的手足口病。可较大规模爆发和流行，危害严重。据多种依据可进行不同分型，Brown等分析VP1核酸序列的同源性，首先将EV71划分为A\B\C基因型。后来B型又分B1～B5，C型又分C1～C5。VP1位于病毒包膜蛋白外，面对最大的免疫压力，可解释血清学的差别和提供最可靠的分子流行病学信息，是目前分型最多采用区域。但VP4位于膜蛋白内部，无免疫压力，故其分型准确性存在争议。非结构区存在基因重组问题，故分型可靠性不高。 2）在病毒诊断方面，已尝试建立ELISA和WB等免疫学方法检验EV71抗体，PT-PCR是目前最为快速有效的检测方法之一，多重PCR-芯片杂交法具有较高准确性。 3）通过PCR方法扩增出VPl基因，定向克隆到原核表达载体pET-21b(+)，阳性质粒转化入E．coli B121(DE3)感受态细胞经IPTG诱导，SDS电泳和蛋白免疫印迹分析目的蛋白的表达水平。纯化的VPI蛋白用作包被抗原，建立手足口病(HFMD)患者抗一EV71．IgM和IgG血清学诊断方法。该方法具有更高的敏感性和特异性，且所需时间短。中和抗体为疫苗研究提供可能，基因工程疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗成为研究热点。各种动物模型相继出现，日本研究成功的NOD/SCID小鼠感染模型为病毒研究提供便利。 4）在其治疗方面，以对症治疗为主，目前缺乏特异、高效的抗病毒药物。静脉注射丙种球蛋白对EV71引起的中枢神经系统感染有一定疗效，新药Pleconari的口服效果好，对小RNA病毒科的病毒特别是肠道病毒引起的脑膜炎、急性弛缓性麻痹等有较好的疗效。Ev7l近年已引起多次流行，研究发现Ev7l的基因型在流行中不断变化，某些位点的基因突变可能会影响EV71的致病性，但仍需进一步研究探讨Ev7l、CVA16等肠道病毒在HFMD中的动态变化、病毒变异、基因型与基因重组等问题；应该研究不同基因型间、变异株间的致病性和表型以及是否具有交叉保护作用；更为迫的是要开展疫苗的研究工作，同时应建立用于评价疫苗免疫效果及其病毒毒力的敏感的细胞、动物模型和相应试剂及方法，以期推动中国EV71的防治工作。 今后发展动态及待解决问题： 根据Ev7l研究已取得的进展，将来的研究重点应集中在以下几个方面： ①在已获得部分毒株序列的基础上，进一步开展血清和分子流行病学调查，完善病毒流行规律、流行特点和基