实验五 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.doc

实验五 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 一、实验目的 1、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理与方法 2、熟练分光光度计的使用和操作方法 二、实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 三、实验器材 1、实验仪器 分析天平、722型分光光度计、5mL移液管、研钵、量筒 2、实验材料和试剂 1）绿豆芽 2）标准蛋白质原液：称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，即为1mg/mL的标准蛋白质原液。 3）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 四、实验步骤 1、标准曲线绘制 取6支试管，按下表加入各 试剂。 试管号 试剂 0 1 2 3 4 5 100 μg/ml牛血清白蛋白溶液／ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水／ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝液／ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。 以各管相应标准蛋白质含量（μg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。 2、绿豆芽蛋白质样品的制备 取两根新鲜绿豆芽的下胚轴，称量并记录重量后，放入研钵中，研成匀浆，用5ml蒸馏水份三次，把研钵冲洗干净，将全部液体转入试管中待用。 3、样品测定 试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。 根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。 五、实验结果 样品蛋白质含量 (μg/g 鲜重) =[查的蛋白质含量 (μg/g) ×提取液总体积 (ml)] / [样品鲜重 (g)×测定所取提取液体积(ml)] 六、注意事项 （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。 （2） 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于 比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的 比色杯洗干净。