实验一 SDS法提取植物基因组DNA.docVIP

PAGE PAGE 2 实验一：SDS法提取植物基因组DNA 【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。 【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作； 2.获得高纯度、完整DNA样品。 一、原理： 利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55—65℃）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 二、药品试剂及耗材： —— 液氮 —— 提取缓冲液：500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl ph8, 50 mmol/L EDTA ph8，10 mmol/L 2-巯基乙醇（用前加入） 20% SDS ph7.2 5 mol/L KAc 氯仿：异戊醇（24：1） —— 异丙醇 —— 70%乙醇 —— TE缓冲液 :10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,PH8.0 耗材： 移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套 离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套 棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪刀 三、操作程序 将1 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。 加入1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120μl 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。 加入0.45 ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀， 12000 rpm离心15 min。 转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20℃放置30分钟沉淀核酸。 25℃，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。 弃上清，70％乙醇洗两次。 凉干DNA，溶于50 μl ddH2O（或TE biffer），4℃保存备用。 各药剂作用： 平衡酚（Tris饱和）：用Tris碱饱和的苯酚，其作用是去除蛋白质 重提缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）? 有机合成的中间体； ??????????? 0.1mol/L? EDTA?（pH8.0）?? 螯合溶液中的金属离子（Ca2+）； 0.5%???????? SDS???????????阴离子表面活性剂； 氯仿：抑制核酸酶，提苯酚； 异戊醇：异戊醇可快速分层，去气泡； 异丙醇：能与自由水紧密结合。结合了溶解DNA的水分子，使DNA沉淀。可常温沉淀，离心，加入体积为0.5—0.7V，但，不易除去，故用70%酒精多洗几次，否则对酶切，连接有影响。 无水乙醇：易于从DNA沉淀中除去。但-20℃放置10~30min，离心T：4℃，加入沉淀剂体积大（2倍），由于使用的管多为一次性，故浪费。 蛋白酶K（Proteinase K）：无RNA酶和DNA酶活性，有降解天然蛋白质的能力； RNA 酶：分解RNA。 要点1：某些植物种的DNA由于褐色多酚类化合物的存在会出现变色现象，这种变色通常不会影响后续的实验操作。但如果发现有影响的话，可以在一定量的2-巯基乙醇，防止酚氧化，对DNA有一定稳定作用。或在提取缓冲液中加入2%（W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），与酚类结合，有助于除去多酚类杂质。 要点2：将SDS溶液加入到化冻的提取物中时，可能会有沉淀析出，要保证析出的SDS重新溶解，以及65℃保温时提取物混匀。 要点3：在高浓度（1mol/L）的钾离子存在的情况下,十二烷基磺酸钠(SDS)会与蛋白或多糖结合变成不溶性的十二烷磺酸钾复合物,这类复合物通常呈絮状,必须要经较高转速离心和Miracloth纱布过滤予以去除. 要点4：若沉淀难于重新溶解,可在65℃加热10min.