人参二醇组皂甙对缺血再灌注心肌超微结构线粒体的影响.docxVIP

人参二醇组皂甙对缺血再灌注心肌超微结构线粒体的影响 根据该实验，人参总枣的这种对心肌缺血再注射损伤的保护作用，但由于其溶血反应有限，不适用于临床应用。PDS具有人参总皂甙的药理作用,且无溶血反应。但应用离体作功心脏模型观察缺血再灌注后心肌超微结构线粒体的变化,比较不同浓度的PDS对心肌缺血再灌注损伤的保护作用,国内外尚未见报道。本实验对此进行研究,以便为PDS的临床应用提供参考。 1 材料和方法 1.1 动物和食物 吉林大学实验动物部提供的大耳白兔30只,雌雄不拘,体重2.5±0.3kg,随机分成1个对照组与4个实验组,每组6只。 1.2 离体兔心灌注液 PDS精制品由吉林大学基础医学院化学教研室提供,从吉林人参中提取,经高效液相色谱测定,纯度为92%,含皂甙单体Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd。再由吉林大学中日联谊医院制剂室制成1ml含10mgPDS的静脉注射液。St.Thomas医院Ⅱ号液为基础心脏停搏液,用于对照组;该溶液内加入不同剂量的PDS,使其浓度分别为40、80、160、320ml/L[以PDS(40)、PDS(80)、PDS(160)、PDS(320)表示],用于4个实验组。每组心脏停搏液的成分如下(单位mmol/L):NaCl 110,KC1 16.0,MgCl216.0,CaCl21.2,NaHCO310.0。渗透压:0.835kPa (1kPa=7.5mmHg),pH7.8,温度恒定37℃。对照组除不加PDS外,余完全相同。离体兔心灌注液采用改良的KHB缓冲液,组成如下(单位mmol/L):KH2PO41.0,KCl 4.4,MeSO41.2,CaCl23.0,NaHCO3 24.9,NaCl 118.6,Na2-EDTA 0.5,Glucose 11.1。灌注时以95%:5%的氧与二氧化碳气体在氧合器内氧合。经测定灌注液氧分压为74.5kPa。 1.3 体作功兔心模型设备 北京医用仪器厂和天津医疗仪器厂生产的离体作功兔心模型所需设备,包括动力型恒温水浴、灌注泵、灌注管道、气体流量计与温度计等。日产JEM-1200EX电子显微镜。 1.4 心肌灌注及检测 根据Langendorff-Neely模型原理制作离体作功兔心模型。经兔耳缘静脉注入肝素(3mg/kg),5min后击头处死,迅速开胸取下心脏,置于4℃的KHB液中低温保存,心脏在2～4s完全停跳。立即插入主动脉及左心房灌注管,以8.0kPa的压力行主动脉恒温(37℃)逆行灌注,心脏在5～30s内自动复跳。心搏稳定后继续灌注10min,停止主动脉灌注,开放左心房灌注管,左心克服7.5kPa的静水压而作功,将灌注液射入主动脉管道。左心作功10min,在心耳上取心肌标本。然后停止左房灌注,阻断主动脉,立即以5.33kPa的压力经主动脉根部灌注37℃的心脏停搏液10ml/kg,心脏迅速停搏。30min、60min后再以同样条件分别灌注心脏停搏液各1次。最后一次灌注完毕后,在心耳上取心肌标本。然后开放主动脉,重新行主动脉逆行灌注,心脏自动复跳。10min后,停止主动脉逆行灌注,开放左心房灌注管,心脏再次作功。20min后再次取心肌标本。活检的心肌由吉林大学基础医学院电镜室制成电镜标本,在电镜下观察心肌线粒体的变化。线粒体的改变应用Flameng线粒体半定量法评价记分。将对照组及4个主动脉阻断前、阻断60min及恢复再灌注30min的每个电镜标本随机选择10个视野,每一视野随机选择10个线粒体,按此法将线粒体的改变分为0～4级,并按等级记分。然后算出100个线粒体的平均分数,进行统计学分析。线粒体分级标准:0级;正常超微结构的线粒体;1级:结构基本正常,基质颗粒丢失,基质电子密度低;2级:浓集的线粒体;3级:基质透明,嵴断裂或基质中出现絮状凝集;4级:基质丢失,嵴断裂,外膜不完整。 2 诱导停跳时间 对照组及4个实验组的取心时间(从取心脏到首次主动脉逆行灌注)为30～50s;诱导停跳时间(从灌注停跳液到心肌机械活动停止)10～15s;复跳时间(从开放主动脉到出现第1次心跳)55～80s。组间差异均不显著(P0.05),线粒体记分结果见附表。 3 抗心肌缺血再灌注损伤作用 心肌缺血再灌注损伤主要发生在心内直视术与冠状动脉旁路移植术及溶栓术后。其发生机制被认为是毒性氧自由基与钙离子超负荷所致。大量的氧自由基和细胞内钙沉积造成产能单位线粒体损伤和功能障碍,使ATP生成和储备减少,从而不能修复缺血期受损但仍可望成活的心肌细胞。并且细胞膜的转运是依靠ATP能的过程,ATP耗竭的结果是细胞水肿,心肌顺应性降低,冠脉阻力增高,血流量减少,心功能减退。线粒体对缺氧十分敏感,在心肌缺血早期即有形态改变。因此,在判断心肌早期损伤时,线粒体的变化已成为最重要的评定指标。本实验结果表