实验巨噬细胞酸性磷酸酶显示课件.pptxVIP

实验八、巨噬细胞酸性磷 酸酶显示 n 是在组织切片上或被检材料上，加一定试剂， 使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成 为有色沉淀物，以用光镜观察，若为重金属沉 淀，可以用电镜观察，称电镜组织化学( electron microscope histochemistry)。这种方 法可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核 酸与某些金属元素等。如进一步应用显微分光 光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较精 确地进行定量研究。 n 最常用的显示方法是过碘酸- 雪夫反应(periodic acid Schiff， PAS反应)。 n 基本原理是：糖被强氧化剂 过碘酸(HIO4)氧化后，形 成2-醛基；后者与Schiff试剂 中的无色品红亚硫酸复合物 结合，形成紫红色反应产物, PAS反应阳性部位即表示多 糖的存在。 1. 糖类显示法 n 脂类物质包括脂肪与类脂。 n 标本可用甲醛固定、 冷 冻切片、用油红、苏丹 Ⅲ、苏丹Ⅵ、苏丹黑B、 尼罗蓝等脂溶性染料染 色；亦可用锇酸固定兼 染色，脂类呈黑色。 3．脂类显示 n 显示DNA的传统方法为Feulgen反应。 n 切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解, 其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的 键打开,使脱氧核糖的一端形成游 离的醛基,这些醛基在原位与 Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶 液)反应,形成紫红色的化合物,使 细胞内含有DNA的部位呈紫红色 阳性反应.紫红色的产生,是由于反 应产物的分子内含有醌基,醌基是 发色团, 因此具有颜色. n 如用甲基绿-派若宁反应，可同时显 示细胞内的DNA和RNA。 n 甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿 色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结 合呈红色。 4．核酸显示法 酸性磷酸酶显示实验原理 n 酸性磷酸酶能分解磷酸脂(常用β-甘油磷酸钠) 而释放出磷酸基。在pH5．0的环境中，磷酸 基能与铅盐(硝酸铅，捕捉剂)反应形成无色 的磷酸铅 (微细沉淀，可在电镜下观察)，再 经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀 (可在光镜下观察)，以此显示酸性磷酸酶在 细胞内的存在与分布。 1 、6％淀粉肉汤 牛肉膏 0 ．3g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 0 ．5g 可溶性淀粉 6g 蒸馏水 100ml 高压灭菌9．9×104pa(15磅)20min 2 、10％中性福尔马林(pH6．8~7．1) 甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g 实验试剂及用品 配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份， 一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者 缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到5．0 ，可加少量醋酸的调整。 注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用 前配制，不能贮存。 附： 0 ．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6)配制方法 0.2mol/l醋酸(ml) 25.5 0.2mol/l醋酸钠(ml) 24.5 3、酸性磷酸酶作用液 配方： 蒸馏水 0 ．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6) 5％硝酸铅 3.2％β—甘油磷酸钠 90ml 12ml 2ml 4ml 4、1％硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml 5、姬姆萨染液(1：30) 姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液(pH6．8) 5ml 6、加足量酸性磷酸酶作用液覆盖样品，放37℃ 水浴箱中反应30min。 7、自来水漂洗片刻。 9、在通风橱中加硫化铵反应10min。 10、自来水冲洗，甩干。 11、直接加PBS封片(或用1∶30的Giemsa染液 染色15min再封片)。 n 阳性标本细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的 颗粒和斑块。 12、镜检 作业 1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同 2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活 性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活 性