he感光通路基因pch-1和smo在鼻咽癌组织中的表达及其生物学意义.docxVIP

he感光通路基因pch-1和smo在鼻咽癌组织中的表达及其生物学意义 hgm信号通道（hh）是与细胞生长发育密切相关的信号通道，在胚胎发育中起着重要作用。Hh信号通路各组成部分的突变或异常表达会导致各种发育缺陷或肿瘤, 包括前脑无裂畸形、 髓母细胞瘤、 R-T综合征、 小细胞肺癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 BCC等。Hh 信号的接收和传导由位于靶细胞膜上的PTCH和SMO控制。PTCH是接受Hh信号蛋白的受体, 含12次跨膜结构域, 在人类中存在两个同源基因PTCH-1和PTCH-2 。SMO的作用是 Hh 信号的转换器, 含7次跨膜结构域, 属于G蛋白偶联受体FZ/SMO超家族成员。当没有Hh蛋白时, PTCH通过下游信号抑制SMO, 当Hh蛋白结合到PTCH时, 解除了对SMO的抑制作用, SMO可以上调信号通路的下游靶基因表达。人类 PTCH是一种肿瘤抑制基因, PTCH的突变在痣样基底细胞癌综合征、 单发基底细胞癌、 髓母细胞瘤、 脑膜瘤、 神经外胚瘤, 乳腺癌、 食管癌、 鳞状细胞癌和毛发上皮瘤等病例中均被发现。在对基底细胞癌和髓母细胞瘤的研究中发现, PTCH-1的功能缺失性突变以及SMO的功能获得性突变可以引起 Hh 信号通路的激活。目前, 大量研究表明 Hh 信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生发展有密切关系, 且在 Hh 信号通路中PTCH-1和SMO起关键性作用, 而在鼻咽癌中对于Hh信号通路的研究又甚少。因此, 本研究选择 Hh 信号通路的PTCH-1和SMO作为研究对象, 应用实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织中PTCH-1和SMO基因的表达情况, 并与鼻咽炎患者的鼻咽组织相比较, 探讨Hh信号通路与鼻咽癌发生之间的关系, 以寻找鼻咽癌诊断和治疗的生物标志物。 1 材料和方法 1.1 组织标本的年龄 32例鼻咽癌组织取自2008-02/2009-09中山大学附属第一医院黄埔院区及中山大学附属第二医院门诊患者, 年龄20～72岁, 中位年龄46岁, 其中男20例, 女12例。所有组织标本均为鼻咽活检组织, 经病理学检查确诊, 鼻咽癌组织学分型为未分化型非角化性癌, 所有患者均尚未接受化疗或放疗。对照组采用常规切片确诊为慢性鼻咽炎患者的鼻咽部组织, 共32例, 年龄19～70岁, 中位年龄46岁, 其中男17例, 女15例。用于实验的活检组织取出后立即至于RNAlater保存液中, 4℃过夜后于-80℃冻存, 用于RNA提取。RNAlater保存液为QIAGEN公司产品。 1.2 方法 1.2.1 rna的分离纯化 取冻存组织, 液氮研磨后每50～100 mg加入1 mL TRIzol 试剂, RNA的提取按TRIzol试剂说明书进行。提取的RNA用DNase I 处理, 以消化残存的DNA污染。用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用紫外分光光度计检测RNA的纯度和含量。根据M-MLV反转录试剂盒, 用Oligo (dT) 引物合成cDNA, 存于-20℃备用。TRIzol 试剂为 Invitrogen 公司产品, DNase I消化试剂盒和M-MLV反转录试剂盒购于TaKaRa公司。 1.2.2 ptch-1和smo基因检测 根据GenBank人类PTCH-1和SMO基因mRNA序列 (登录号: NM 000264和NM 005631) , 用Primer 5 设计引物, 并用Blast软件在GenBank中进行同源性比对, 选择特异性好的引物。PTCH-1基因上游引物: 5′-TGACTCCCAAGCAAAT-3′, 下游引物: 5′-ACTCTGATGAACCACCTC-3′, 扩增的目的片段长度为131 bp; SMO基因上游引物: 5′-CCTGGTCACTCCCCTTTGTC-3′, 下游引物: 5′-GCACGGTATCGGTAGTTC TTGT-3′, 扩增的目的片段长度为112 bp。用β2微球蛋白 (β2 microglobulin) 为内参基因, 上游引物: 5′-ATGAGTATGCCTGCCGTGTGA-3′, 下游引物: 5′-GGCATCTTCAAACCTC CATG-3′, 扩增的目的片段长度为101 bp。全部引物由上海英骏生物技术公司合成。 1.2.3 rtaqcda聚合酶链反应ld-pcr 取鼻咽癌和鼻咽炎组织的反转录产物cDNA 0.5 μL为模板, 分别进行PCR扩增PTCH-1、 SMO基因和内参 β2m 基因。25 μL的PCR反应体系为: 2.5 μL 10×PCR Buffer, 2 μL dNTP Mixtrue (2.5 mmol/L) , 0.125 μLrTaqDNA聚合酶 (5 U/μL) , 上下游引物 (10 pmol/μL) 各1