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南海红树林底泥来源放线菌no 真菌病是一种多发性疾病，很难治愈。近年来,随着全球气候变化,温室效应的加剧,由真菌引起的疾病,特别是诸如手足甲癣及深部真菌病等日趋严重。同时,随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的应用、肿瘤化疗和器官移植手段、艾滋病的出现,以及导管、插管等在大型手术中的普遍开展,使真菌感染的发病率呈现上升趋势,全身用抗真菌药物成为抗微生物药的研究热点之一。 海洋微生物次生代谢产物是新颖结构和活性天然产物的重要来源,也是具有新颖结构和新作用机理的抗真菌药物发现的重要源泉。在海洋微生物中,放线菌是迄今最重要和最大的药用微生物种群。据不完全统计 ,近年来50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的。因此,开发海洋放线菌具有巨大的潜力。 本研究团队以深部真菌感染的主要致病菌白色念珠菌(Candida albicans)为指示菌,采用纸片扩散法(Kirby Bauer,KB法)测定样品的抑菌活性,从两千余株采自世界各地的放线菌中筛选得到一些具有较好的抗真菌活性菌株。选取其中一株海洋放线菌H75-11进行活性追踪,并最终追踪和分离得到天然抗真菌活性抗生素抗霉素(antimycin),本研究主要报道该株放线菌的发酵、活性成分的提取分离和结构鉴定。 1 实验材料 1.1 放线菌菌 放线菌No. H75-11由广东省农业科学院植物研究保护所保存和提供,菌株从广东湛江近海红树林的底泥中分离得到。 1.2 水ms47h2o 高氏一号培养基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,K2HPO40.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO40.01 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,琼脂 15 g,水 1000 mL,pH 7.2～7.4。 摇瓶培养基:KNO31 g,K2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g,海水晶0.5 g,可溶性淀粉 20 g,酵母膏20 g,水1000 mL,pH7.2～7.4。 1.3 高分辨质谱、ndmo 紫外光谱(UV)用JASCO V-550紫外/可见光谱仪测定;ESI-MS采用Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪;高分辨质谱采用Agilent 6210 LC/MSD TOF质谱仪测定;核磁数据采用Bruker AV-400型核磁共振仪测定;硅胶(200-300目)(青岛海洋化工厂); Sephadex LH-20 (Pharmacia公司);核磁用氘代试剂(Merck公司);色谱级甲醇(山东禹王公司);液相用水(广东怡宝公司生产的纯净水);其它试剂均为分析纯。 2 发酵罐、放大培养 菌种活化:将保存的菌种转接到高氏一号培养基中,30 ℃培养7 d。 摇瓶培养:挑取活化的菌种转接到装有100 mL 摇瓶培养基的500 mL 三角瓶中,30 ℃、200 r·min-1条件下培养5 d。 发酵罐放大培养:采用Biostatc 30L生物发酵罐进行放大培养,所用培养基为高氏一号液体培养基,30 L罐装液量20 L,初始pH值7.0～7.2,种龄48 h,接种量10%,发酵温度:28 ℃,搅拌速度300 r·min-1,通气量15 L·min-1,培养3 d。整个发酵过程中pH值先降低后缓慢增高。 3 醇中脂肪酸的萃取 通过预试验的活性追踪可知,发酵液无明显抑菌活性,活性成分主要集中在菌丝体的乙酸乙酯萃取部位。因此活性成分提取工艺如下:收集发酵第3天的产物,8 000 r·min-1离心30 min,收集菌体,将菌丝体置于pH3.0、70 %乙醇中振荡24 h,浓缩醇提液,样品用一定量的90 %甲醇水溶解,然后用等倍量的石油醚萃取4次,除去里面大量的脂肪油成分,甲醇部位浓缩,加一定量水混悬,乙酸乙酯萃取4次,萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物6.1 g。 乙酸乙酯萃取物6.1 g经硅胶柱色谱,石油醚/丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脱,最后再用甲醇冲柱,获得B1～B13共13个馏分,采用上述纸片扩散法,以白色念株菌为指示真菌,测试这13个馏分的抑菌圈大小,结果显示馏分B4与B5具有明显的抑菌效果,将B4与B5合并成B4-1(1.17 g),将活性馏分B4-1经反复的硅胶柱色谱和Sephadex LH-20凝胶纯化,获得6个化合物1(9mg),2(20 mg),3(9 mg),4和5(共13 mg)及6(5 mg)。 4 化合物结构鉴定 化合物1:白色针晶,分子式C28H44O3。ESI-MSm/z: 429 [M+1]+, 879 [2M + Na]+.1H NMR (400MHz, CDCl3, TMS内标):δ6.49 (1H, d,J=8.4 Hz, H-7), 6.23 (1H, d,J=8.4 Hz, H-6), 5.2