免疫原和抗血清的制备课件.pptxVIP

免疫原和抗血清的制备 第一节免疫原的制备 • 免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质 • 一、颗粒性抗原的制备： • 1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。 2.细菌抗原： • H抗原 有动力的菌株 O抗原 100℃ 2-2.5h 为了 破坏H抗原，获得O抗原抗 • 3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射 原 二、可溶性抗原的制备： 组织和细胞粗抗原的制备： 1.组织和细胞混合抗原的制备： 组织匀浆制备： 标本要求：新鲜或低温 (＜-40℃) 保存的去除表面包膜或 结缔组织或一些大血管，脏器应进行 灌注，除去血管内残留 血液 制备 处理好组织→0.05％3生理盐水洗净→剪成小块 粉碎→高速组织捣碎机法→2000-3000离心10 研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨 →上清 10000-20000 20-30高速离心 • 细胞抗原 细胞膜蛋白抗原 细胞浆抗原 细胞核及核膜抗原 粉碎： (1) 反复冻融法 (2) 冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸 (3) 超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏 (4) 自溶法：利用组织和微生物的自身酶系 需一定和温度动物组织 0-4℃ 微生物 室温 (5) 溶菌酶法：一定 (8.0) ，溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和 组织 (6) 表面活性剂处理法 2.细胞抗原的制备： 蛋白质抗原的制备和纯化： 可溶性抗原绝大部分为蛋白质 1.超速离心和梯度密度离心法： 用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质 1) 差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离 2) 梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重 力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之 上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高， 即所谓梯度 3) 第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷 适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋 白质抗原不适用此法 2.选择性沉淀法： • 用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀 1) 核酸除去法： (1) 提取沉淀剂： (2) 核糖核酸酶降解法： 用或酶与提取液作用30-60 (4℃) ， 即可除去核酸 (1) 抗原的粗筛 33-50％饱和度的硫酸铵 (2) 提取丙种球蛋白 主要为 33-40％饱和度的 硫酸铵 (3) 抗原的浓缩 3) 有机溶剂沉淀法： 有机溶剂多为酒精和丙酮 4) 水溶性非离子型聚合物沉淀法： 蛋白质颗粒→沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配 分子量2000-6000可用于沉淀蛋白浓度不同可沉淀不同3-4％沉淀免疫 复合物6-7％沉淀 8-12％沉淀 12-15%沉淀其他球蛋白 2) 盐析沉淀法： 25％沉淀白蛋白 • 1) 分析筛层析又名凝胶过滤，将分成大、中、小三种 大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不 同 2) 离子交换层析：离用带离子基因的纤维素 流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组 常用纤维素 (二乙基氨基乙基纤维素) 根据携带电荷不同 (溶液中等电点不同) 常用于分离 因为分子量大 凝胶过滤洗脱曲线 3.凝胶过滤和离子交换层析： 4.亲和层析： • 利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间 的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 ：和，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和 辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力， 可紧密结合成复合物. 1) 亲和层析支持物的选择： 常用：琼脂糖珠 ( 2B、4B、6B) • 2) 配体的选择： 3) 抗原或抗体与支持物的结合： 步骤： (1) 活化支持物上的功能基因 溴化氛11 与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因 (2) 交联 (联接) (3) 清洗：除去未结合的 (4) 亲和层析条件的选择： • 原理：一定条件下，和能可逆性地结合成复合物，当条件改变 (如稀酸、 稀碱、浓盐、加温等) 时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在 不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。 • 根据这一原理，将可溶性抗原 (或抗体) 用化学方法偶联到不溶性载体上， 当将相应的抗血清 (或抗原) 按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗 体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的值和 离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的解离 (加入解脱剂) ，经洗脱， 从而得到纯化的。 • 2) 配体的选择： . 抗原或抗体与支持物的结合： 步骤： (1) 活化支持物上的功能基团 溴化氰11 与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团 (2) 交联 (联接) (3) 清洗：除去未结合的 (4)