乳酸菌菌种的分离筛选方法解读.docxVIP

PAGE PAGE 8 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用 MRS 琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 菌有 TYC 菌有 TYC 培养基、MS 培养基。M17 培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径 0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在 MRS 培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80 等物质，也 常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的 依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 一.筛选方法：乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿 酵母膏 油酸 吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含 CaCO3 的培养基上产生 CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入 CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的 PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至 10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养 2.溴甲酚绿指示剂法：48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在 MRS 培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺 4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS 培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 二.菌种的分离筛选筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌 二.菌种的分离筛选 1.培养基： 1.培养基： ★1.1 麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L 预先灭菌碳酸钙 5-10g/L PH 自然 （分离用） ★★1.2 牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁 200g/L 葡萄糖 10g/L 吐温 0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5（分离用） ★1.3 番茄汁碳酸钙培养基： 酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁 100mL 蛋白胨 7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分离用） 1.4 葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5 1.5 蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/L MgSO 4 0.3-0.5 g/L MnSO 4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5 1.6 蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆 0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO 4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5 （发酵或种子培养基） ★★1.7 ★★1.7 MRS 培养基 （分离培养计数用） 蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0g、 柠檬酸氢二铵 2.0g、 葡萄糖 20.0g、 吐温 80 1.0mL、 乙酸钠 5.0g、 磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、 蒸馏水 1L, pH 6.5。（分离培养基）， 当 MRS 培养基冷却至 45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。 1.8 BCP 1.8 BCP 培养基（溴甲酚紫培养基） 乳糖 5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫 10ml 自来水 1000ml pH6.5-7.0 （分离用） 1.9 BC