山东大学细胞生物学试验方法.pptVIP

一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H尿嘧啶核苷显示RNA。 在研究蛋白质和粘多糖时，分别选用3H氨基酸 、3H甘露糖、 3H岩藻糖等。 本文档共111页；当前第62页；编辑于星期二\1点32分 3H-尿嘧啶脉冲标记的细胞，示异染色质区（核内白色区）无转录活性 本文档共111页；当前第63页；编辑于星期二\1点32分 五、超离心技术 高速离心：10000—25000r/min 超速离心：转速大于25000r/min 沉降系数（ “S”—Svedberg unit）: 单位离心场中溶质分子的沉降速度 1S 相当于1?10-13s 离心目的：分离细胞器与生物大分子及其复合物 大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。 本文档共111页；当前第64页；编辑于星期二\1点32分 离心种类： 分析离心： 用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等 制备离心 ： 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯） 本文档共111页；当前第65页；编辑于星期二\1点32分 本文档共111页；当前第66页；编辑于星期二\1点32分 微粒体(microsomes) 在超离心时，分离出的小泡状成分，系由内质网等膜的碎片组成，小泡的外表面常附有核糖体，是研究糙面内质网功能活动的良好材料。 本文档共111页；当前第67页；编辑于星期二\1点32分 本文档共111页；当前第68页；编辑于星期二\1点32分 本文档共111页；当前第69页；编辑于星期二\1点32分 六、分子杂交技术（molecular hybridization) 原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA, DNA-RNA或 RNA-RNA杂交的双链分子。 本文档共111页；当前第70页；编辑于星期二\1点32分 方法： 原位杂交 体外分析核酸的主要方法★ Southern blotting又称DNA印迹法 Northern blotting又称RNA印迹法 本文档共111页；当前第71页；编辑于星期二\1点32分 原位杂交（in situ hybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术。染色体在高pH值条件下，DNA解链，带标记的核酸探针即刻与染色体一定部位杂交。既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。 带放射性的DNA探针，放射自显影；免疫探针法。 本文档共111页；当前第72页；编辑于星期二\1点32分 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交 本文档共111页；当前第73页；编辑于星期二\1点32分 荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA（黄） 本文档共111页；当前第74页；编辑于星期二\1点32分 七、PCR技术：聚合酶链式反应 原理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和临床诊断等。一般可扩增106-107。 DNA聚合酶：Taq酶，来源于一种嗜热水生菌。最适作用温度75-80度，95度下短时间不失活。 本文档共111页；当前第75页；编辑于星期二\1点32分 第三节 细胞生理学技术 1、膜电位检测技术 细胞内外存在电位差（20~100mV）称为膜电位，膜电位的变化反应了细胞的生理变化 2、膜片钳位记录技术 主要用于检测单个特定离子通道性质及变化 3、细胞电泳 细胞表面带有许多电荷，因而可以在外加电场的作用下移动 本文档共111页；当前第76页；编辑于星期二\1点32分 第四节实验操作技术 一、细胞培养 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动十分困难。 活细胞离体培养 本文档共111页；当前第77页；编辑于星期二\1点32分 （一）动物细胞培养 20世纪初，Harrison（1907）两栖类胚胎神经管组织悬浮培养，神经细胞存活多天，观察到神经细胞分化成神经元，伸出了轴突。 20世纪40年代，W. Earle和R. Dulbecco设计出细胞培养液配方，并将组织分散成单个细胞进行悬浮培养，细胞培养工作广泛展开。 本文档共111页；当前第78页；编辑于星期二\1点32分 本文档共111页；当前第79页；编辑于星期二\1点32分 电镜与光镜的主要区别： 光镜 电镜 光源