Sanger法测序原理-动画版.ppt

双脱氧法基因测序技术生物化学（下） 第40章第二节 基因测序----获取DNA碱基组成测序技术的发展： -1977年 W. Gilbert发明化学法 F. Sanger发明双脱氧链终止法 -2001年 完成人类基因组框架图 -2005年 第二代测序技术：高通量测序 -2009年 第三代测序技术：单分子测序 理解生命本质改造/创造生命 双脱氧链终止法（Sanger法） 1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入2’, 3’-双脱氧三磷酸核苷ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 “双脱氧末端终止”的含义dNTPddNTPG:CA:TC:GG:CA:TC:G脱氧核苷酸三磷酸双脱氧核苷酸三磷酸 引物5’端-OHDNA聚合酶-CTAAGCTCGACT模板3’端ATCGdNTP1234TGCA加入常规PCR底物加入ddNTP管1：ddTTP;管2：ddGTP;管3：ddCTP;管4：ddATP;32P同位素标记PCR反应开始进行Sanger法流程（放射自显影） PCR反应变性退火延伸一条引物！ -CTAAGCTCGACT5’端引物模板3’端-GATTCGAGCTGA1TT-GAT5’端-G5’端A5’端ddTTPT-GATTGCACGT2G5’端-G5’端-GATTCG5’端-GATTCGAG5’端-GATTCGAGCTGddTTPddGTP 1234放射性自显影电泳读出碱基序列获得互补链（模板）的序列ddGTPddTTPddCTPddATP Sanger测序法的改进改进：标记物+电泳方法1970s 同位素标记，手工1980s 荧光标记，计算机自动识别1990s 阵列毛细管电泳 1234ATCG同时加入不同荧光标记的ddATP，ddTTP，ddCTP，ddGTP加入正常PCR所需的底物进行PCR反应ATCGTTTGGGAAC四色荧光标记+毛细管电泳 A C G T峰图优点：自动化程度高；分辨率高；成本低分子体积（大小）激光聚焦荧光扫描检测 第一代测序 第二代测序通量10年10天人类基因组计划：耗时十年，耗资几十亿，3 Gb 核心：边合成边测序技术 Sequencing-By-Synthesis, SBS流程：Flow Cell (芯片）上，利用桥式PCR反应， 借助可逆阻断技术实现每次合成一个碱基， 并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团 捕获激发光，从而读取碱基信息。2006年，Illumina推出第一代Genome Analyzer（GA）GA的升级： 1Gb -- 30 Gb -- 50 Gb—300Gb—1 T/runHiseq2000平台: 10天的运行中获得300Gb以上的数据， 读取的碱基长度达到150bp左右。Solexa测序系统 可逆+阻断OHX可逆阻断技术 边合成边测序1合成第一个碱基清除未反应的碱基和试剂激发荧光信号测量4次荧光信号去掉阻断基团与荧光基团234下一个CycleCC 通过荧光信号获得序列信息5一簇基因发出的荧光信号对应一个点 思考题： 查阅Solexa测序系统的工作流程，特别是桥式PCR原理。 Sanger法测序原理小结(1) 2’, 3’-双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)(2) ddNTP随机掺入到新合成的DNA链上，导致链合成提前终止(3) 按长度（大小）电泳分辨(4) 检测：放射性自显影/荧光标记(5) 发展：四色荧光标记+毛细管电泳 高通量测序：Solexa系统