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分光光度法实验教学的思考 生物学是一门以实验为基础的学科。实验教学是生物学教学的重要内容和环节。随着科学技术的发展, 生物学研究也从定性研究向定量研究过渡。在众多定量测定分析技术中, 分光光度法的应用最为普遍。因此, 作为教学仪器, 紫外/可见分光光度计也从大学课堂走向中学课堂。如何更好地使用分光光度计, 有效提高教学效果, 培养学生的创新思维和动手能力, 是教师必须面对的问题之一。 1 检测系统组成 在有关分光光度法的教学实验中, 教学环节从介绍分光光度计原理入手, 能起到举一反三的效果。但应注意的是在教学中不应过多介绍Beer-Lambert光吸收定律及推导公式, 重点在于分光光度计的组成和应用。尤其是对物理、化学基础较差的学生, 过多的公式推导容易让学生产生深奥感而排斥学习。各种型号的紫外/可见光分光光度计, 不论何种形式, 基本上都由五部分组成:光源、单色器、样品、接受检测放大系统、显示或记录器。前三部分构成光学系统, 后两部分构成电学系统。两个系统的组合把物质的光吸收变化转变成电流变化, 从而定量分析物质的含量。 (1) 光源分为可见光源和紫外光源。前者常用钨灯, 适用波长范围是400~760nm;后者常用氘灯, 适用波长范围是195~400nm。 (2) 单色器是分光光度计的心脏部分, 它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光, 并能通过调节波长选择所需入射光路中单色光的波长。单色器中核心元件——色散元件也已从棱镜向光栅等更精密的元件过渡。波长的选择和单色光质量是分光光度法测量精确度的关键。 (3) 样品室是放置待测样品的位置。待测样品一般盛在吸收池内 (即比色杯) 。比色杯有普通光学玻璃和石英玻璃杯两种。前者由于吸收紫外光, 只能用于可见光波长测定, 适用波长范围是400~2000nm。后者可透过紫外光、可见光和红外光, 适用波长范围是180~3000nm。 (4) 接受检测放大系统是接收透过比色杯的光强, 并以电信号显示出来, 主要元件是光电转换设备。常用的检测器已从最初的光电管、光电信增管、光电二极管等转换为电荷耦合器件 (CCD) 等, 从而有更强的光电转换效果。 (5) 显示装置是将光吸收值显示出来, 早期是以电流表显示, 现已逐渐用数显或计算机等所替代, 从而减少读数误差。 2 测定样品时注意使用比色杯 在了解基本原理的基础上, 分光光度计的使用主要从以下几个方面着手: (1) 光源和波长的选择根据所测定的物质的性质, 选择合适的光源和波长。一般在可见光范围选择钨灯, 紫外选择氢灯, 但现在也有的紫外/可见分光光度计在设计上已取消光源选择, 只要一打开机器, 两种光源都打开。初学者常犯的错误是忽视波长的选择, 教学中常遇到的事情是学生把样品测完了才发现波长选错了, 究其原因是没有检查波长设置。因此, 在教学中, 我们经常强调使用分光光度计时, 第一步是打开电源, 第二步就是检查波长。如果是继续别人后使用仪器, 则第一步就是检查波长。 (2) 样品测定用于分光光度计测定样品物质含量的基本原理是, 样品在一定波长下光吸收值的大小与样品中该物质浓度成正比。而最好的线性关系是在光吸收值为0.3~0.7时。因此, 测定前要经过预实验确定合适的样品浓度, 让反应后的待测溶液的光吸收值位于这个范围内。否则, 待测数据不能正确反映实际变化。学生常有的一个误区是光吸收超过1.0以上时, 将待测液稀释后测定。实验数据表明, 这种做法是不正确的, 样品稀释应该在反应前而不应在反应后。 如果不同样品之间浓度差异较大, 则在测定时应先测定低浓度 (浅色) , 再定测高浓度 (深色) , 这样可以避免反复洗比色杯。不仅节省时间, 还可以避免洗杯后润洗所造成的误差。为了减少比色杯的光吸收误差, 除了测定前校正比色杯外, 可以在测定中平行样品间使用同一个比色杯测定。 当分光光度计使用时, 每次测定样品时应先用对照校正零点 (机器和光吸收) , 然后再将待测样品拉入光路进行测定。实际操作时也可以只校正光吸收零点, 当光吸收零点出现较大误差时, 再全部校正。因为分光光度法是以物质光吸收作为设计基础的, 一般测定时常以蒸馏水等作为参照调正仪器的零点和光吸收的零点。测定样品得到的光吸收值减去空白管光吸收值, 再去计算含量。但实际上, 比较以空白管代替蒸馏水管来调仪器的零点和光吸收零点, 所测得的光吸收值和一般操作所测定的光吸收值是一样的。但这样做的结果不仅简便了实验操作, 而且消除了试剂本身的光吸收值。 (3) 比色杯的使用如前所述, 测定范围在可见光时选用普通玻璃比色杯, 石英比色杯则在紫外/可见光范围使用, 由于石英比色杯价格较贵, 所以测可见光时尽量选用普通玻璃比色杯。拿比色杯时手指不能触摸透光面, 放入样品室时应让光路穿过透光面,