DNA合成原理及操作课件.pptVIP

DNA合成原理及操作规范;DNA合成原理及操作;合成原理;第一步：脱保护（Deblocking）:用三氯乙酸（TCA）去除CPG所链核苷上的DMT保护基团，暴露5′羟基，供下一步缩合。 第二步：活化（Activation）：单体与催化剂四唑混合进入合成柱，四唑转移一个质子给3′亚磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的氨是四唑亲核进攻的离去基团，二异丙酰胺被四唑取代，形成亚磷酰胺-四唑活性中间体。;第三步：偶合（Coupling）:亚磷酰胺-四唑中间体与CPG所连接的核苷酸的5′羟基发生缩合反应，缩合脱掉四唑，形成延长一个碱基的核苷酸链。 第四步：盖帽（Capping）:少量未反应（2%）的载体上的核苷酸链的5′羟基会在后续的循环中参加反应，生成少一个碱基的核苷酸链，因此需要在反应后进行封闭。常用乙酰化反应与5′羟基缩合成酯键，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙酰化试剂。;第五步：氧化（Oxidation）:偶合反应形成的三价亚磷酸酯键很不稳定，因此要用氧化剂——碘的四氢呋喃溶液将三价磷氧化成稳定的五价磷。 依此步骤循环，最终得到一个全长DNA片段粗品。 用新鲜的浓氨水把粗品从载体上切割下来，采用适当的纯化方式去除短片段和氨基脱保护及氰乙基脱保护形成的盐离子。;DNA合成作业流程; 3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。一般40bp