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反义寡核苷酸在肿瘤治疗中的研究进展 反意义病毒对抗技术的基本原则是根据waton-crick碱性遗传因素的互补规律和核电站混合原理，设计一个可与靶基因特定区域相结合的互补碱含量，并将特定序列的序列结合起来，以影响靶基因的表达并抑制其功能，但其他基因的记录和表达并不受影响。封闭单个基因表达的反义的概念由Zamecnik和Stephenson首次描述, 20多年来, 大量研究证实了ASODN特异性抑制基因表达的能力, 人们也逐渐认识到其在疾病治疗方面的巨大潜能。随着生物技术特别是人类基因组计划的飞速发展, 反义药物的研究引起人们的极大兴趣, 现已成为药物研究和开发的热点。本文就这一方面的研究进展作一综述。研究表明反义寡核苷酸 (ASODN) 在体内外具有特异性抑制基因表达的能力, 通过相应反义寡核苷酸对目标基因表达的调控, 可以达到预防和治疗肿瘤的目的。肿瘤基因治疗的实施主要包括以下三个方面:①寻找具有治疗意义的目标基因;②建立有效的靶向基因载体系统;③发挥治疗效应。随着DNA微阵列技术发展, 肿瘤基因表达可以得到高通量检测, 并筛选出对特定肿瘤具有治疗意义的目标基因。利用反义核酸技术按同源重组原则, 合成已知基因的反义寡核苷酸, 与相应的癌基因特异地结合, 封闭其转录和翻译, 使癌基因失活。反义寡核苷酸疗法已在肿瘤学研究中广泛应用, 有些已经进入了实验和临床阶段, 主要集中于癌基因和细胞因子等领域见表1。 HSP-27:热休克蛋白27;VEGF:血管内皮生长因子;XIAP:X哺乳动物凋亡蛋白抑制因子;RNR:核糖核苷酸还原酶;TGF-β2:转化生长因子β2 1 反之亦然杂谢剂对肿瘤细胞的影响 1.1 不同致病性化合物对bcl-2和骨髓瘤细胞凋亡的影响 Bcl-2基因定位于18q21, 由230kb组成, 在特异性 (14;18) (q24;q21) 染色体易位中, Bcl-2基因转位至14号染色体免疫蛋白重链JH片段, 从而致Bcl-2基因表达失控。Bcl-2基因主要抑制细胞凋亡, 不刺激细胞增殖, 在肿瘤早期, 各种致癌因子使细胞内Bcl-2基因活化和大量表达, 抑制致凋亡因素诱导的细胞凋亡, 为肿瘤发展提供了条件。Tortora等用Bcl-2反义寡核苷酸 (Bcl-2 ASODN) 分别处理人结肠癌细胞株GEO、卵巢癌细胞OVCAR3和乳腺癌细胞株ZR751及GEO致瘤裸鼠, 结果表明, Bcl-2 ASODN在体内、外均能抑制Bcl-2 表达, 使细胞凋亡增加。Donk等将Bcl-2 ASODN与骨髓瘤细胞共同培养, 2d后Bcl-2 mRNA水平下降超过75%, Bcl-2 ASODN可不断进入细胞内, 下调Bcl-2的表达, 增强多发骨髓瘤的治疗效果。Marcucci等对老年急性白血病人连续静脉输注Bcl-2 ASODN配合道诺霉素等化疗, 结果显示Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白明显降低, Bcl-2 ASODN能增强化疗效果, 而不增加化疗的副作用。 1.2 pkc治疗肿瘤的作用机制 蛋白激酶C (PKC) 是一类依赖于Ca2+和磷脂的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 能够被多种生长因子、激素和神经递质激活, 并通过使底物蛋白磷酸化产生多种生物效应, 如激素分泌、跨膜转运及调节基因表达、细胞增殖和分化、细胞凋亡及多药耐药等, 故PKC在信号转导、细胞增殖调控和肿瘤发生中起着重要作用, PKC至少有11种亚型, 其中PKC-α在多种常见的恶性肿瘤中高表达。针对PKC-αmRNA的ASODN在Ⅰ期临床试验中, 用于治疗淋巴癌、卵巢癌及星状细胞瘤等有较好的抑瘤效果, 副作用较弱并可逆转。Wang等用PKC-α反义寡核苷酸作用于人类肺癌细胞株LTEPa-2, 研究显示, ASODN明显抑制肺癌细胞LTEPa-2增殖、克隆形成及其PKC-α蛋白表达, 其裸鼠的成瘤率亦明显降低, 并且发现实验组细胞的致癌基因 (Ha-ras, c-jun, 和 c-fos) mRNA水平不同程度下降。 1.3 h-rasasodn的应用 Ras/Raf促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号转导途径是生长因子信号转导的重要途径, 在很多肿瘤中都发现Ras或Raf基因的异常表达, 并可能是导致预后不良的因素之一。Fluiter等研究显示, 仅用不超过5 nM的H-ras ASODN就能有效降低多种肿瘤细胞株H-Ras mRNA水平, 抑制肿瘤细胞生长, 在活体内0.5mg/kg/天的剂量就能抑制肿瘤生长, 且无毒副作用。Liao等利用人肝癌细胞株和裸鼠研究H-ras ASODN对肿瘤形成、凋亡和转移的效果, 结果显示H-ras ASODN不仅在体内外明显抑制细胞增殖和增加细胞凋亡, 且能减慢裸鼠成瘤和肿瘤肺转移。Raf为Ras的效应基因, 实验显