超高效液相色谱-紫外检测技术同时测定水产品肌肉组织中6种抗真菌素的含量.docxVIP

超高效液相色谱-紫外检测技术同时测定水产品肌肉组织中6种抗真菌素的含量 螺旋酶素、替米考星、chiel细菌素和北里霉属于环内酯类抗生素。这种大环内酯药物主要用于动物，能抑制革兰氏阳性和部分革兰氏阴性、真菌和螺旋体的出现。近年来,大环内酯类药物在水产养殖中的新应用日益受到关注。王秀珍等报道了北里霉素与对照药物泰乐菌素防治草鱼“三病”的研究。随着研究的深入,替米考星等大环内酯类药物对人体的危害也逐渐被人们所认识,如大环内酯可产生交叉耐药性,高残留会对人类造成致敏性和毒副反应,尤其是敏感个体等。1999年以来,欧盟禁止将泰乐菌素与螺旋霉素作为促生长剂添加到动物饲料中。我国农业部颁布的NY5071-2002《无公害食品、渔药使用准则》中规定禁止泰乐菌素在水产养殖中使用。我国和欧盟还规定了动物组织中螺旋霉素、替米考星、北里霉素和泰乐菌素的最高残留量。 目前,动物组织和牛奶中大环内酯类药物残留的测定多采用液相色谱-质谱法,而测定水产品中该类药物的报道较少。 Horie等采用液相色谱电喷雾质谱法测定水产品中的大环内酯类药物,也有报道采用高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中红霉素、鳗鱼中大环内酯类残留、鱼肉中林可酰胺类和大环内酯类抗生素残留,以及液相色谱法同时测定水产品中螺旋霉素和泰乐菌素。而水产品中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素和北里霉素同时测定的液相色谱和超高效液相色谱法尚未见报道。超高效液相色谱法由于具有分析速度快、灵敏度高等优点而得到广泛应用。本文首次采用超高效液相色谱-紫外检测法(UPLC-TUV)建立了同时测定水产品中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素和北里霉素的分析方法。 1 实验部分 1.1 仪器和萃取 ACQUITY UPLC超高效液相色谱(美国Waters公司)配TUV双通道紫外检测器及Empower 2色谱工作站;Mettler-Toledo AE-240型精密电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);20PR-520型自动高速冷冻离心机(日本日立公司);FS-1高速匀浆机(常州华普达教学仪器有限公司);调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂);HGC-12氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司);RE-2000E旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司);固相萃取装置(德国CNW公司);Oasis HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg,Waters公司)。 替米考星标准品(纯度不低于98%)、泰乐菌素标准品(纯度不低于99%)、北里霉素标准品(纯度不低于72%)、螺旋霉素标准品(纯度96%) 均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司,乙酸乙酯、正己烷、乙腈、甲醇(色谱纯,美国J.T.Baker公司);磷酸二氢铵(天津大茂化学试剂厂)、磷酸二氢钠(天津福晨化学试剂厂)、氯化钠(天津东丽区天大化学试剂厂)、酸性氧化铝(上海五四化学试剂有限公司)、乙醚(上海马陆制药厂)均为分析纯;磷酸(优级纯,天津光复精细化工研究所);鲫鱼由市场购买,南美白对虾肌肉样品为送检样品。 1.2 实验方法 1.2.1 肌肉样品的解冻 鱼洗净去鳞、去皮,沿脊背取肌肉;虾洗净去头、去壳,取肌肉部分;甲鱼等取食用部分;样品均质混匀于-18 ℃冰箱中保存,备用。 测定时,将匀浆冷冻保存的肌肉样品于室温下自然解冻。准确称取10.0 g样品置于50 mL离心管中,加入30 mL乙腈,涡旋振荡混匀1 min,4 500 r/min离心10 min,取上清液置于鸡心瓶中。向残渣中再加入15 mL乙腈重复提取1次,合并提取液于鸡心瓶中,置旋转蒸发仪浓缩至近干,加入5 mL 4% NaCl溶液溶解残渣,涡旋振荡混匀30 s,再加入5 mL正己烷,涡旋振荡混匀1 min,静置5 min,弃去上层正己烷层,重复去脂1次。 1.2.2 hlb固相萃取柱及洗脱 将HLB固相萃取小柱以5 mL乙腈、5 mL水活化后,将水相过固相萃取柱(柱流速保持1滴/s),用10 mL蒸馏水、10 mL 5%乙腈水溶液淋洗HLB固相萃取柱,用8 mL乙腈洗脱,洗脱液置50 ℃氮吹仪上吹干。向残渣中加入1 mL初始条件的流动相定容,涡旋振荡混匀1 min,经0.22 μm滤头过滤于进样瓶中,UPLC-TUV分析。 1.2.3 标准溶液配制 分别准确称取各标准品0.01 g(精确至0.000 1 g),用乙腈分别溶解并定容至100 mL,配制成100 mg/L标准储备液,-20 ℃冰箱中冷藏。测定时将各标准溶液混合后稀释成0.1、0.2、0.5、1、5、10、15、20 mg/L的混合标准溶液。分别以螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素的峰面积(A)为纵坐标,质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程及相关系数(r)。 1.2.4 u3000酸相及梯度洗脱程序 ACQUITY UPLC BEH C