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rass抗剂对自发性高血压大鼠心肌缝隙连接蛋白cs43表达的影响 *沈阳市科技规划项目（no.a1-264-1-48）和沈阳医学院科技基金（no.2010-20）。 通讯作者, E-mail: lmliu@126.com 高血压是危害我国人民健康最常见的心血管疾病之一,它是动脉粥样硬化、冠心病及脑卒中的主要危险因素,可以导致不可逆转的心血管重构。肾素血管紧张素醛固酮系统(renin angiotensin aldosterone system,RAAS)过度激活是高血压的发病机制之一。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)作为循环和局部主要的效应分子,在高血压的发展和维持上起着重要作用。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)雷米普利,AngⅡ受体拮抗剂替米沙坦,以及选择性醛固酮受体拮抗剂依普利酮是目前临床常用的新型降压药。每种药物均有各自的优势,单用任何一种抗高血压的效果相似,联用后可能产生叠加效应,但副作用也可能加倍。 近年来,缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)正逐渐引起人们的重视,它是心肌细胞间缝隙连接的主要蛋白成分,对细胞间信息传导、细胞生长、分化及维持心肌节律性同步收缩有重要意义。研究表明,心脏Cx43含量的改变与高血压引起的心室重构有密切联系。针对RAAS的降压药有可能通过影响Cx43的表达改善高血压引起的心室重构。本研究在自发性高血压大鼠中,研究上述3类抗高血压药物单用或联用的心肌保护作用以及对Cx43 mRNA和蛋白表达的影响。 1 材料和方法 1.1 试验和测定仪器 雷米普利、替米沙坦、依普利酮原料药,武汉富驰生物有限公司。一抗兔抗大鼠多克隆抗体、二抗羊抗兔抗体,武汉博士德生物有限公司。辣根过氧化酶羊抗兔IgG抗体,美国Jackson公司。透射电子显微镜H-500型,日本日立公司产品。病理组织切片机,Leitz1512,德国Leitz公司产品。鼠尾动脉血压心率测定仪,日本Softron Co Ltd公司研制。7170A全自动生化分析仪,日本日立公司。凝胶自动成像及分析系统Chemi Imager5500,美国Alpha Innotech公司产品。 1.2 分组及治疗方法 8周雄性、体质量约200 g的自发性高血压大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:0157712。分为高血压组、雷米普利组、替米沙坦组、依普利酮组、雷米普利+替米沙坦组、雷米普利+依普利酮组、依普利酮+替米沙坦组,每组10只,自由取食及摄水,适应性喂养1周后开始实验。各组给药剂量分别为,雷米普利组2.5 mg/(kg·d),替米沙坦组10 mg/(kg·d),依普利酮100 mg/(kg·d),联合组取半量,混合于少量蒸馏水灌胃治疗,对照组取同周龄、同体质量Wistar大鼠,取同体积蒸馏水灌胃,疗程8周,每周测体质量,根据体质量调整药量,联合用药取半量。 1.3 血压检测计数 所有大鼠于给药前、首次给药后第4周末和第8周末时各测量1次,每只大鼠每次测量3遍,取平均值计算收缩压和舒张压,应用血压测量系统软件读取血压数值。 1.4 ang浓度检测 8周后所有大鼠均腹腔注射5 mL/kg体质量的水合氯醛活体麻醉,处死动物,取腹主动脉血2 mL,注入预先冷却的抗凝管中摇匀,4 ℃,离心5 min,分离血浆,置于-10 ℃冰箱保存待测。血浆AngⅡ浓度检测采用放射免疫法,按试剂盒(购自武汉博士德生物技术有限公司)说明书进行。后取出心脏,测量左心室质量及左心室质量/体质量。同时,将一半左心室组织置于40 g/L中性甲醛液中固定,经石蜡包埋后,取心脏冠状面最大横径处切片,连续切片3张,切片厚4 μm,用于HE染色,以观察组织的大致形态和心肌细胞走向,及心肌纤维化、细胞形态学及炎细胞浸润情况。 1.5 离心条件下离心 大鼠处死后,取左室心肌组织置于玻璃匀浆器中,加入裂解缓冲液,4 ℃下手工碾磨。而后4 ℃、14 000×g下离心15 min,取上清液。对提取的蛋白质进行总蛋白含量测定,制胶,制备蛋白质样品并加样,免疫印迹显色,烤干保存硝酸纤维素滤膜或摄影,图像分析仪测定目的蛋白与内参β-actin吸光度(A)值的比值作为目的蛋白的相对表达量。 1.6 序列及pcr扩增 大鼠处死后,取左室心肌组织置于-80 ℃,检测时采用Trizol提取总RNA,而后逆转录为cDNA。以cDNA为模板,进行PCR反应,扩增靶基因和内参。参照GenBank设计并合成引物。引物序列为:Cx43,F5′-TGGGTTCAGCTTGAG CGCGG-3′,R5′-GGCGAGAGTGGAGCCGTTGG-3′,扩增序列长度为588 bp;β-actin,F5′-