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第八章 酶免疫技术 酶免疫技术(2)课件 1 教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或 抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及 原理 4.掌握酶免疫测定的应用 酶免疫技术(2)课件 2 三大经典标记技术 三大经典标记技术 酶免疫技术(2)课件 3 酶免疫技术(2)课件 4 酶免疫技术(2)课件 5 + • 酶标抗体(抗原) 与抗原(抗体)的 特异性反应 • 酶对底物的显色反 应 • 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析 酶免疫技术(2)课件 6 酶标抗体 抗原 E 底物 E (一)标记酶的要求： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得 酶免疫技术(2)课件 7 纯度数(RZ)值与 酶活性无关，酶活 性单位(U)比RZ值 更为重要 糖蛋白(主酶) 亚铁血红素(辅基) 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 国内以辣根过氧化酶最为常用 RZ值： 403nm (辅基) 与275nm (主酶) OD值之 比 酶的纯度并不代表 酶的活力 酶免疫技术(2)课件 ( 8 HRP DH2+H2O2 → → → D+2H2O HRP催化的反应式为： 酶免疫技术(2)课件 9 HRP常用底物 邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应 后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致 癌性。 四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性， ELISA中应用最广泛的底物。 酶免疫技术(2)课件 10 敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。 是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取 对-硝基苯磷酸 酯( pNPP ) 酶免疫技术(2)课件 11 AP的 底物 源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。 酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。 酶免疫技术(2)课件 12 β-Gal 的底物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 酶免疫技术(2)课件