原生质体的培养与融合.pptVIP

1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。 （二）高pH-高Ca离子法 本文档共49页；当前第30页；编辑于星期一\14点1分 PEG法特点： 融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低 植物+植物 植物+动物 动物+酵母 Polyethylene Glycol（聚乙二醇） （三）PEG法 本文档共49页；当前第31页；编辑于星期一\14点1分 PEG法原理 PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。 本文档共49页；当前第32页；编辑于星期一\14点1分 PEG法示意图 - + - 桥梁 + - PEG被洗掉 + - + - 电荷重排 + - + - + - + - 膜接触 本文档共49页；当前第33页；编辑于星期一\14点1分 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞 （四）PEG结合高钙-高pH诱导法 本文档共49页；当前第34页；编辑于星期一\14点1分 (五)电融合技术 Senda 首先用此方法实现原生质体融合 细胞融合仪 本文档共49页；当前第35页；编辑于星期一\14点1分 第十一章 原生质体的培养与融合 本文档共49页；当前第1页；编辑于星期一\14点1分 原生质体的分离与纯化 原生质体培养 原生质体融合 本章主要内容 本文档共49页；当前第2页；编辑于星期一\14点1分 原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 本文档共49页；当前第3页；编辑于星期一\14点1分 微 丝 叶绿体 线粒体 质 膜 细胞核 内质网 微 管 细胞壁 高尔基体 植物细胞模式图 液 泡 本文档共49页；当前第4页；编辑于星期一\14点1分 第一节 原生质体分离及纯化 一、原生质体分离 双子叶外植体 胚性细胞 本文档共49页；当前第5页；编辑于星期一\14点1分 多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。 （一）材料来源 禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。 本文档共49页；当前第6页；编辑于星期一\14点1分 （二） 分离方法 机械分离法 酶法分离法 本文档共49页；当前第7页；编辑于星期一\14点1分 1、机械分离法（Machanical isolation） 优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大 本文档共49页；当前第8页；编辑于星期一\14点1分 （1）酶的种类 纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶 2、酶法分离（Enzymatic isolation） 本文档共49页；当前第9页；编辑于星期一\14点1分 本文档共49页；当前第10页；编辑于星期一\14点1分 （2）酶液的配制 渗透压稳定剂及pH 酶的配比及浓度 果胶酶：浓度不宜超过2%, 纤维素酶(1-2%) 渗透压稳定剂:（500－600mmol/L甘露醇) 本文档共49页；当前第11页；编辑于星期一\14点1分 （3）分离原生质体 两步分离法 一步分离法 方法有二： 叶肉原生质体分离提纯 本文档共49页；当前第12页；编辑于星期一\14点1分 图示原生质体分离过程（以叶片为例） 过滤、离心 加果胶酶 和纤维素酶 本文档共49页；当前第13页；编辑于星期一\14点1分 叶片 愈伤组织 本文档共49页；当前第14页；编辑于星期一\14点1分 二、 原生质体纯化与活力测定 （一）原生质体纯化 方法三种 离心沉淀法 漂浮法 界面法 本文档共49页；当前第15页；编辑于星期一\14点1分 1、 离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 本文档共49页；当前第16页；编辑于星期一\14点1分 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含