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一株产红色素新粘质沙雷氏菌的筛选 灵菌红素是一种天然红素，具有三种环结构，主要包括红素、非双螺、cyllonin和mekolodisin。灵菌红素均具有一定的免疫活性,如抑制真菌、细菌和霉菌等功效,且具有一定的抗肿瘤作用,因此具有很大的药用价值,受到科研工作者的极大关注。目前灵菌红素主要是通过微生物发酵法获得,能产生灵菌红素的微生物主要有Streptomyces、Serratia和Pseudomonas等种属,其中以Serratia属微生物生物合成灵菌红素的报道居多。近年来,随着微生物资源的进一步开发,不断有新的具有产灵菌红素能力的菌株被发现。海洋细菌是研究热点,越来越受到研究人员的重视,袁保红等人从广东大亚湾海水中分离到产灵菌红素的新型菌株Rhodomarinobactersp.,具有较强的产灵菌红素能力。目前,对于灵菌红素的应用主要集中在药理、临床及如何获得高产菌株等方面。 微生物资源极其丰富,目前已被人类开发的仅占少部分,因此,从自然资源中筛选得到具有高产灵菌红素的微生物仍然是一条非常有应用前景的途径。本文从土壤中筛选得到的一株具有生产红色素能力的红色短杆菌,由生理生化实验和16SrDNA的序列分析表明该短杆菌为粘质沙雷氏菌,但是该菌种生理生化实验中的赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及精氨酸双水解酶实验与报道的粘质沙雷氏菌的结果不一致,因此这是一株新的粘质沙雷氏菌亚种Serratiamarcescenssubsp.H31,本文以此菌株为出发菌株,对其发酵条件进行了研究,最终发酵液中红色素的OD535和生物量分别达到142.638和15.29g/L,进一步通过UV和TOFMS等方法确定该色素为灵菌红素。 1 材料和方法 1.1 病毒 本实验室从土壤中筛选得到的粘质沙雷氏菌Serratiamarcescenssubsp.H31。 1.2 培养条件和培训 1.2.1 斜培养基g.l 蛋白胨10、牛肉膏3、氯化钠5、琼脂20、pH 7.2~7.5。 1.2.2 种子培养部位g.l 葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏3、氯化钠5、pH7.2~7.5。 1.2.3 基础发酵培养基g.l 葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏3、氯化钠5、pH7.2~7.5。 1.2.4 基础发酵培养基的制备 从斜面培养基中挑2环菌体于种子培养基中,于温度25℃,150rpm的摇床培养中16h后,按10%的接种量接于基础发酵培养基中,再于温度25℃,转速150rpm的摇床中培养72h。 1.3 测量 1.3.1 生物量的测量 发酵液于12000rpm的条件下离心10min,弃去上清后将得到的菌体用蒸馏水洗涤3次,最后将菌体于60℃烘箱烘干至恒重。 1.3.2 检测甲醇的吸光度 取发酵液1mL于12000rpm离心10min,用蒸馏水洗涤菌体2次,加入5mL甲醇,反复振荡提取两次,将两次提取液合并,静置10min,再12000rpm离心10min,取上清液稀释10倍,用721型紫外分光光度计测定其在535nm下的吸光度值,空白为甲醇。 1.3.3 光谱分析色素光谱分析 用U-3000紫外分光光度计在200~800nm波长段扫描。 1.3.4 capo内部4.3.4%+ 分析条件:仪器MircomassQ-TOFmicro质谱仪;溶剂:甲醇;离子化方式:ESI(+);Capillary3000V;SampleCone 35V;ExtractionCone 3.5V;SourceTemp.80℃;DesolvationGas 200L/h;PumpFlow 10μL/min。 2 结果与讨论 2.1 糖酸糖的糖液组成对糖酸钠基础发酵培养基的影响 碳源在微生物的各种营养需求中,需求量最大,不仅提供了细胞代谢产物的碳骨架,而且还是细胞最重要的能量来源。为此进行了不同碳源对色素产量影响的研究,分别加入等量的果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、甘油和半乳糖,替代基础发酵培养基中的葡萄糖,其结果如图1所示。 由图1可知,该菌可以利用二糖,己糖,戊糖,三碳糖,以菌体的生物量和色素产量为指标分析,双糖优于单糖,酮糖优于醛糖,其中以蔗糖为碳源,菌体干重达到8.15g/L,用甲醇提取得到色素溶液在535nm下的吸光度值达到33.173,由此确定该菌发酵色素的最佳碳源为蔗糖。 2.2 生长结果分析 分别选用牛肉膏、蛋白胨和酵母膏等不同氮源,加入等摩尔的氮代替基础发酵培养基中的蛋白胨和牛肉膏,其色素产量和菌体生长结果如图2。 由图2可知,氮源对菌体的生长和色素的形成有显著的影响,有机氮源中含有一些其它的营养因子,促进菌体的生长,因此有机氮源培养的生物量明显高于无机氮源,相应的色素的产量也明显高于无机氮源发酵的产量。当以牛肉膏为氮源时,生物量和OD535均为最大值,分别为8.64g/L和36.387。因