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视黄醇结合蛋白的纯化、抗血清的制备和检测方法的建立的中期报告 引言： 视黄醇结合蛋白(retinol binding protein, RBP)是一种小分子蛋白质，负责维生素A的运输。该蛋白主要由肝脏合成，也广泛存在于人体的其他组织和液体中，如血浆、脑组织、卵巢、胚胎等。RBP的浓度变化可能与某些生理和病理状态有关。因此，建立一种可靠的RBP检测方法具有很高的临床意义。 本文主要介绍对RBP进行纯化、制备和检测抗血清的中期工作进展。 实验材料和方法： 材料：新鲜人血浆、RBP专一免疫抗血清、异丙醇、甲基丙烯酸与二乙氨基乙酯（MAEDA）反应物、SDS凝胶、ECL发光液。 实验步骤： 1. RBP的纯化：采用蛋白A亲和层析法纯化RBP。将新鲜人血浆加入含蛋白A亲和树脂的柱子中，在含有0.1M苏糖的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)下洗脱，并检测各洗脱小管的蛋白质含量。 2. 纯化的RBP的鉴定：采用SDS凝胶电泳法鉴定纯化后的RBP蛋白质，用ECL发光液显化序列。 3. RBP抗血清的制备： 将纯化后的RBP蛋白质与MAEDA反应生成RBP-MAEDA复合物，然后免疫兔子，收集抗血清进行检测。 4. RBP的ELISA检测方法建立： 抗血清的效价测定、制备标准曲线、RBP的浓度测量等。 结果： 1. RBP的纯化：采用蛋白A亲和层析法，获得了一组含有目标蛋白的纯化物。通过检测不同洗脱分段的蛋白质含量，确定了目标RBP位于其中一个洗脱分段。 2. 纯化的RBP的鉴定：通过SDS凝胶电泳法，获得了两个主要的蛋白质条带，其中一个条带大小适配于RBP的分子量大小，另一个条带可能是与RBP相互作用的蛋白。 3. RBP抗血清的制备：排除质量不合格的兔子，获得了一组具有良好特异性的RBP抗血清。 4. RBP的ELISA检测方法建立：研究不同浓度下RBP的吸附曲线，确定最佳条件时，RBP的ELISA检测灵敏度高、重复性好、特异性强。 结论： 本文采用蛋白A亲和层析法纯化了RBP，通过SDS凝胶电泳法鉴定了纯化后的蛋白质，使用MAEDA进行反应并收集抗RBP抗血清。建立了一种灵敏、特异、重复性好的ELISA检测方法，可用于测量RBP蛋白浓度。这些结果为进一步研究RBP在生理和病理过程中的作用提供了有力支持。