水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法.docxVIP

PAGE PAGE 1 附件 5  水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法 （征求意见稿） 范围 本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。 原理 本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取 小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检 测线（T 线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 试剂 正己烷。 丙酮。 乙酸乙酯。 乙腈 磷酸二氢钠，NaH PO ·2H O。 2 4 2 磷酸氢二钠，Na HPO ·12H O。 2 4 2 氯化钠 复溶液：称取 0.12g 磷酸二氢钠 (3.1.5)置于 100ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液 A；称取磷酸氢二钠 7.16g (3.1.6)置于 100ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液 B。取溶液 A 2.8ml、溶液 B 7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至 100ml，得磷酸盐缓冲液。 3.1.9 丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比 1：9 混匀。 3.1.10 丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比 6：4 混匀。 标准物质 氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度 ≥98.6% 中文名称氯霉素英文名称chloramphenicolCAS 登录号 中文名称 氯霉素 英文名称 chloramphenicol CAS 登录号 56-75-7 分子式 C H CL N O 11 12 2 2 5 相对分子量 323.13 注：或等同可溯源物质。 标准溶液配制 氯霉素标准储备液（1 mg/mL）：精密称取氯霉素标准品（3.2）适量，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL 的氯霉素标准储备液。4℃ 避光保存，有效期 6 个月。 氯霉素标准中间液 A（10μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1 mg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10 μg/mL 的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期 3 个月。 氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液 A（10μg/mL）（3.3.2）0.01 mL分别置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01 μg/mL 的氯霉素标准工作液。临用新配。 材料 固相萃取小柱：Cleanert Silica，200mg/6ml。LOT：0170198 免疫胶体金试剂盒（在 2℃～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。 金标微孔。 试纸条或检测卡。 仪器和设备 移液器：200 μL、1 mL 和 5 mL。 涡旋混合器。 离心机：转速≥4000 r/min。 电子天平：感量为 0.01 g。 振荡器。 样品浓缩仪：如有需要。 4.7 环境条件:温度：15℃～25℃，相对湿度：≤60%。 分析步骤 试样制备 取具有代表性样品约 500 g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。 试样提取和净化 准确称取试样 6g（精确至 0.01g）置于 50mL 具塞离心管中，依次加入 4mL 水和 8mL 乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5min，以4000r/min 离心 5min。转移全部乙酸乙酯层于50mL 具塞离心管中，加入正己烷 25ml，氯化钠 1g 涡旋混匀，4000r/min 离心 1min，上清液待净化。5ml 丙酮 -正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗 LC-Si 硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用 5ml 丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于 40℃氮气吹干，精密加入 600μ L 复溶液（3.1.8），涡旋混合 1min，作为待测液。 测定步骤 检测卡与金标微孔测定步骤 吸取 150μ L 样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 5～10 次使混合均匀，室温温育 3 min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8 min，对结果进行判定。 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取 150μ L 样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 5