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加替沙星原料药中相关杂质的分离及结构鉴定 加替沙星[gatiflavone，1-环丙基-6-氟-8-甲基-7-（3-甲基-1-羟基）-1，4-二羟基-4-氧代-3-羧酸-4-]是一种新的全合成氮氮酮类抗菌剂，具有广和有效的光谱和效率。对各种呼吸道疾病、革兰氏阳性细菌的mssa、肠球菌和厌氧菌都有良好的效果。本文用液相色谱-质谱联用技术分离并鉴定了加替沙星原料中的主要相关杂质,并合成了两个化合物:1-环丙基-6-氟-8-甲氧基-7-(1-哌嗪基)-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸(简称DMP)和1-环丙基-6氟-8-羟基-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸(简称DMO)。DMP的液相色谱、紫外吸收光谱及质谱分析结果分别与相关杂质一致,确证了加替沙星原料中相关杂质的结构为DMP。此工作尚未见报道。 仪器和检测方法 仪器与试药Agilent 1100 LC/MSD系统,包括二元溶剂泵、真空脱气机、自动进样器、内置柱切换阀的柱温箱、光二极管阵列紫外检测器和ESI接口的四极质谱检测器。 加替沙星原料药、DMP和DMO,中国药科大学医药化工研究所提供;乙腈HPLC级,德国E.Merck公司;乙酸为分析纯,水为超纯水。 色谱与质谱条件色谱柱为Zorbax SB-C18,5 μm,4.6 mm×150 mm,Agilent公司,美国;流动相:3%乙酸/乙腈-3%乙酸水溶液为15∶85;流速1.0 mL·min-1,柱温25℃;色谱柱流出物依次经紫外和质谱串联检测,紫外检测波长290 nm。质谱检测参数:电喷雾离子化,正离子方式检测,m/z扫描范围80～600,电喷雾参数:辅助雾化气(N2)压力279.5 kPa,干燥气(N2)温度350℃,流量11 L·min-1,静电喷雾电压4 000 V,碎裂器(fragmentator):120 V。 加替沙星原料药、DMP和DMO的LC/MS分析分别取加替沙星原料药、DMP和DMO适量,用流动相溶解,分别制成浓度为0.7,0.4和0.2 mg·mL-1的溶液作为供试液,原料药取20 μL,DMP和DMO各取1 μL注入LC/MS系统,记录其色谱图及总离子流图。 加替沙星原料药、DMP混合物的LC/MS分析取加替沙星原料药溶液250 μL及DMP溶液40 μL混合,取混合液8 μL注入LC/MS系统,记录其色谱图及总离子流图。 结果与讨论 1 紫外吸收光谱和相对于m 加替沙星原料药的LC/MS色谱图见图1。主要有关物质的保留时间为6.429 min,其MS图(图2)中,m/z 362.2的峰应为该物质的(M+H)+信号,m/z 384.0为(M+Na)+信号,m/z 406.1为(M+2Na-H)+,故确定该化合物的分子量为361,比加替沙星少14,推断其分子结构较加替沙星少一个亚甲基,其紫外吸收光谱与主成分的UV图相似,提示它们的基本结构相似。 主成分的保留时间为7.138 min,其MS图中,m/z 376.1的峰应为主成分的(M+H)+信号,m/z 398.0为(M+Na)+信号,与加替沙星分子量375相符。 根据上述数据及合成工艺, 推断相关杂质可能为加替沙星中3位为哌嗪取代或8位为羟基取代。 2 加替沙星原料相关杂质的检测 为确证加替沙星原料中相关杂质的结构,合成了两个化合物DMP和DMO(合成及其结构确证将另文发表)。DMP和DMO的LC/MS色谱图见图3。DMP的保留时间为6.645 min,其色谱保留时间、紫外光谱图及质谱图分别与加替沙星原料中相关杂质相一致。 DMO的保留时间为7.520 min,与加替沙星原料中相关杂质的保留时间相差较大。图1B为对加替沙星原料TIC图进行选择提取离子m/z 362检测所得,对应的保留时间为6.428 min,表明加替沙星原料中不含DMO。 由此可确证加替沙星原料中相关杂质为DMP。对加替沙星原料与DMP混合物进行LC/MS分析,对应的相关杂质峰峰高显著增加,进一步证实加替沙星原料中的相关杂质为DMP。 3 沙星药剂中相关杂质的分析 DMP的质谱裂解途径为: 本文的研究结果表明,加替沙星原料药中的相关杂质为1-环丙基-6-氟-8-甲氧基-7-(1-哌嗪基)-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸, 该相关杂质为生产工艺中的原料引入。