细胞的原代与传代培养演示文稿.pptVIP

细胞的原代与传代培养演示文稿 本文档共22页；当前第1页；编辑于星期二\5点35分 （优选）细胞的原代与传代培养 本文档共22页；当前第2页；编辑于星期二\5点35分 原代培养技术的重要意义: 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。 利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。 本文档共22页；当前第3页；编辑于星期二\5点35分 原代培养 消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。 　 消化法 贴块法 冷消化 温消化 一次性消化 分次消化 本文档共22页；当前第4页；编辑于星期二\5点35分 贴块法 消化法 原代培养方法分类 本文档共22页；当前第5页；编辑于星期二\5点35分 93 分次消化 消化法的分类 本文档共22页；当前第6页；编辑于星期二\5点35分 解离释放细胞的方法 最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。 本文档共22页；当前第7页；编辑于星期二\5点35分 动物细胞原代培养流程的示意图 本文档共22页；当前第8页；编辑于星期二\5点35分 器材和液体的准备 细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用 手术器材、瓶塞等 15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌 DMEM培养液、消化液、PBS液等 用滤器过滤后备用??? 本文档共22页；当前第9页；编辑于星期二\5点35分 方法与步骤（举例:心肌细胞消化培养法） （1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腹部消毒。 （2）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取出，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。 本文档共22页；当前第10页；编辑于星期二\5点35分 （3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌三角烧瓶内，加入5～6倍量的0.1％胰蛋白酶液（pH7.4 ～ 7.6），置37℃恒温磁力搅拌器上分次消化：每次消化8-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白酶液于带盖离心管中，加入2滴血清终止消化。直到组织块基本消化完全。 各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗2-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。 本文档共22页；当前第11页；编辑于星期二\5点35分 （4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 ～50万个细胞为宜。 （5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于37℃的CO2培养箱中培养。 （6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。 本文档共22页；当前第12页；编辑于星期二\5点35分 原代细胞培养结果: 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层 本文档共22页；当前第13页；编辑于星期二\5点35分 贴块培养步骤图解 细胞原代贴块培养法 本文档共22页；当前第14页；编辑于星期二\5点35分 本文档共22页；当前第15页；编辑于星期二\5点35分 VSMCs原代培养第4天和第9天（×100） 本文档共22页；当前第16页；编辑于星期二\5点35分