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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1X106cells/ mL以1mL接种于 100mm培养皿 ! 24h后，进展所需的处理〔比如加药,照射） ! 特定时间后终止培养，进展下一步的实验 ! 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中 ! 1000rpm离心5min〔短时低速离心〕 ! 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液的细胞碎片 ! 参加1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下参加3.5ml无水乙醇，混匀 后，于4°C固定30min,或-20°C长期保存。 J 1000r/min,离心 5min ] 将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ] 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ] 吸除离心管PBS,参加200ul PBS和2ul的RNA酶〔0.25mg/ml〕 （37°C下孵育 30min） J J 将离心管的细胞过滤（300um尼龙网膜）至含有PBS的EP管中〔PI具 有很强的粘附性，容易使细胞聚团〕，标记EP管 J 提前一天网上预约 J 开机〔先开仪器后开软件〕 J 流式细胞仪的结构一般分为5局部：①流动室与液流驱动系统；② 激光光源与光束成形系统；③ 光学系统；④ 信号检测、存贮、 显示、分析系统；⑤ 细胞分选系统。 ! 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上 ! 流动室充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ! 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光〔488nm激 发光源〕 ! 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析〔荧光染料和细胞 DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例〕 ! 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 乎乌却的NJPOW——乎乌指甥 b+H? w d + M 行 ”FPJ ■W^K^ad lin^-d dnja^-athrd 叩岫 t?l Him t]E 3UJ pg —in*吓 I ■Otm心 I M + pU UM^-wddV |DtYl F|2J ■4-Cd flram llpq却」 Flowjo软件分析 FCM-DNA量分析1个细胞增殖群时，可将DNA含量分布组方图分 为三局部，即G0/1、S、G2M。G0/1和G2M细胞峰的DNA分布均为 正态分布，S期可以认为是一个加宽的正态分布 ] 检测结果刻录光盘保存 ] 关机〔先关软件后关仪器，关机前需清洗） 正常细胞DNA含量：2n-4n 凋亡细胞：核DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿 膜丢失，胞DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一 个DNA含量小于2n的分布区〔亚G1峰〕。 日?胃Chaflncltji F_2110 日?胃 Chaflncltji F_2 110 ui*itrhl^AyJ-...eri F^otdpMods : FirMc/clft d OipteM! 100.00 牝 Dip G1; 53.W Sdf 55.S-E Cup fW/ 柚蚌 at 17 11 CRp E M H % 1(U hGV 4 3D loUl S*hawil0 5I% Krul M O. 4的气 %r阳帕*富 % Mtn iT； Dwnx □,42 % 4r1# % UlMMo日 awant^ 3,站 AN 巳仁lei ovflnti 366 CvcIq 0vc.nLi-pDr channol E 3 RCB! O KI 1、纵坐标Cell Number:即计数的有效细胞数； 2、 横坐标DNA Content:即DNA含量； 3、 G1、G2、S三期在图中已经标示； 4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平 均值为55.56； 53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%； Dip G2- 5.64% at 107.72，即 G2 期 DNA 含量平均值为 107.72，5.64%即 G2 期细胞数占总数的5.64%； Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡 根本原理： 磷脂酰丝氨酸〔PS〕能与连接素V〔 Annexin V〕发生特异 结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进 入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光， 荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。 正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinV- 凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinV + 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加 PI+/Annexin V + 坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻一一PI+/AnnexinV + 几乎不存在膜结构 PI+/Annexin V- 实