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流式细胞技术 目录 1基本概念 1.1基本结构和工作原理 1.2基本原则 2用于临床 3发展趋势 1基本概念 流式细胞技术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选 技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及 综合利用的高技术产物。 基本结构和工作原理 流式细胞仪由三部分构成1.液流系统，包括流动室和液流驱动系统；2.光学系统，包括激发 光源和光束收集系统；3.电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的工作原 理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕 获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计 算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。用于FCM的样本是单细胞 悬液，可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组 织的单细胞悬液等。 基本原则 1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测；2.针对不同的细胞样本进行 适当洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态； 3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单 细胞悬液；4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50um厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用 前述方法制备单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。 流式细胞技术的应用：1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2.能准确地 进行DNA倍体分析；3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4.快速进行 细胞分选和细胞收集；5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药 性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析(心血管疾病)，流式细胞术与分子生物学研 究。 2用于临床 流式细胞分析仪临床用于细胞治疗中心在FACSVantage革命化的细胞分选功能基础上推出 的分选增强(SortEnhancededition,SE), BD FACSVantage SE,其新功能和新配置通过与标准多 激光多荧光系统以及数据处理系统的完美整合，速度更快，功能更强，是当今流式技术的最 卓越体现。 3发展趋势 当前，临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点，其发展趋势主要体现在以下几个 方面。 从相对细胞计数到绝对细胞计数 流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数，如淋巴细胞可依其表面标志 的不同分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)，T 淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+CD8-)和抑制/细胞毒T淋巴细 胞(C D3+CD4-CD8+ )等。这些亚群细胞计数过去多以相对百分比表达结果，由于百分比 只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现其在单位体积血液中的绝对数 量，而对艾滋病等一些疾病的临床诊断，有时需要考虑细胞的绝对数量，如患者血液中T 辅助/诱导细胞（CD3+CD4+CD8-）的数量＜200个/应，而未发病（仅有HIV感染）者的数 量＞200 个/pL。T淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查，但在国内仅有 少数实验室开展。可以预见，随着干细胞技术的发展，对造血干细胞等的绝对数量分析，不 久的将来，也将作为常规检查项目，走出实验室进入临床。 流式细胞绝对计数在临床可开展的项目包括：①淋巴细胞亚群，尤其是T淋巴细胞亚群的 绝对计数。②外周血或骨髓中造血干/祖细胞的绝对计数。③血液中网织红细胞的绝对计数。 ④血液中血小板数量，尤其是血小板减少症患者血小板的绝对计数，此种计数优于血细胞分 析仪法，已成为血小板计数的国际推荐参考方法。此外，可能出现在血液中的其它一些稀少 细胞（如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等）的计数，也将发展为流式细胞绝对计数。流式细胞 绝对计数的开展对临床疾病的诊断、治疗等有重要意义。 从相对定量到绝对定量分析 细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析，以前多以平均荧光强度MFI）或 相对荧光强度（RFI）表达其含量。由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异，每个实验 室所用仪器的类型也不尽相同，因此，以MFI或RFI表示细胞抗原或受体的表达量缺乏可 比性，虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度，但却无法准确应用这些信息。近年来，为了通 过FCM精确定量分析细胞的某些成分，定量流式细胞术（Quantitative Flow Cytometry， QFCM）逐渐得到发展，其定量分析原理主要有两种：①定量抗体微球法：在特制的微球上 包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子，再将包被不同