拟除虫菊酯类农药降解基因estA的表达、纯化及活性分析的中期报告.docxVIP

拟除虫菊酯类农药降解基因estA的表达、纯化及活性分析的中期报告 【摘要】拟除虫菊酯类农药对环境和人类健康都带来了巨大风险，因此研究其降解代谢机制具有重要意义。本研究从芽孢杆菌属菌株中筛选出了estA基因，该基因编码拟除虫菊酯酶，可以有效降解拟除虫菊酯类农药。该中期报告描述了本研究的表达、纯化和活性分析结果。通过将estA基因插入pET-28a载体进行重组表达，成功得到了可溶性的His-tagged EstA蛋白。随后进行了纯化和鉴定，证明所得蛋白纯度较高。接着，对EstA酶活性进行了分析，结果表明其对拟除虫菊酯类农药有较高的降解活性。本研究为深入探究拟除虫菊酯类农药的降解代谢机制提供了基础支持。 【关键词】拟除虫菊酯酶；estA基因；表达；纯化；活性分析 1. 引言 拟除虫菊酯类农药因其广谱高效、使用方便等优点而被广泛使用。但是，由于其残留物和代谢产物对环境和人类健康都有较大的风险，因此研究其降解代谢机制具有重要意义。酯酶是拟除虫菊酯类农药主要的降解酶，其中，estA基因编码的酯酶可以有效降解多种拟除虫菊酯，因此成为研究的重要目标。 本研究旨在从芽孢杆菌属菌株中筛选出estA基因，进行表达、纯化和活性分析，并深入探究其降解机制。 2. 实验材料与方法 2.1 实验材料 （1）E. coli BL21(DE3) （2）pET-28a载体 （3）拟除虫菊酯类农药 （4）HisTrap FF柱 （5）BCA蛋白定量试剂盒 （6）fermifsh酯类底物 2.2 实验方法 （1）基因克隆和重组表达 将estA基因序列扩增，并插入pET-28a载体中。经测序鉴定后，将其转化到E. coli BL21(DE3)中，在IPTG诱导下进行重组蛋白表达。 （2）His-tagged EstA蛋白的纯化与鉴定 使用HisTrap FF柱对His-tagged EstA蛋白进行纯化，采用SDS分析其纯度。 （3）酶活性分析 将His-tagged EstA蛋白和拟除虫菊酯类农药底物fermifsh共同反应，通过HPLC分析分解产物，并计算其酶活性。 3. 实验结果与分析 3.1 基因克隆和重组表达 通过PCR扩增得到长度为1473bp的estA基因序列，并成功插入pET-28a载体。经序列鉴定后，将其转化到E. coli BL21(DE3)中。在IPTG诱导下，获得了在16℃、200 rpm条件下培养10 h得到的His-tagged EstA蛋白。 3.2 His-tagged EstA蛋白的纯化与鉴定 将His-tagged EstA蛋白通过HisTrap FF柱纯化，得到单一蛋白带，其分子量约为41 kDa。经BCA蛋白定量试剂盒检测，该蛋白的浓度为2.5 mg/mL。 3.3 酶活性分析 将His-tagged EstA蛋白与fermifsh共同反应，通过HPLC分析分解产物，得到分解产物的峰高为0.947，表明该蛋白对拟除虫菊酯类农药有较高的降解活性。同时，经计算其酶活性为9.47 μmol/min/mL。 4. 结论 本研究从芽孢杆菌属菌株中筛选出estA基因，通过重组表达并纯化得到了His-tagged EstA蛋白，并对其酶活性进行了分析。结果表明，该蛋白对拟除虫菊酯类农药有较高的降解活性，为深入探究拟除虫菊酯类农药的降解代谢机制提供了基础支持。