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bmscs与vegf对大鼠脑动脉闭塞趋化性作用的比较 骨髓基质细胞（bmsc）是具有多向分化潜力的非血缘干燥。据研究，bmss在脑中注入脑后，转移到大脑的缺血部分，并与神经细胞和皮质细胞分离。同时，它也添加了胰岛素样的生长因子（igf）、血管皮肤生长因子（vgf）、神经生长因子（ngf）、脑源性神经营养因子（brainer，bdnf）和颅内生长因子（egf）。这些细胞因子在脑损伤的恢复过程中发挥着重要作用。VEGF作为血管内皮细胞特异性的有丝分裂原, 具有促进血管内皮细胞的增殖、迁移和诱导血管生成等作用, 其对脑缺血的作用近年颇受关注。有报道, 大鼠脑缺血后VEGF表达增加, 补充外源性VEGF后, 脑缺血灶体积明显缩小。本实验旨在研究BMSCs治疗脑梗死过程中, 外源性VEGF的补充对BMSCs向缺血部位迁移的趋化性作用。 1 材料和方法 1.1 动物的处置符合动物伦理学标准 ①动物:普通级成年SD大鼠30只, 雌雄不限, 体质量250～320 g;2月龄SD大鼠, 雌雄不限, 均由广东省实验动物中心提供, 动物许可证号:SCXK (粤) 2008-0002 (粤监证字 2008D007) 。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要试剂与材料:DMEM/F12、胰蛋白酶 (购于GIBCO公司) , 胎牛血清 (购于天津灏洋公司) , 5-溴脱氧鸟苷 (BrdU) (购于Sigma公司) , 2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑 (TTC) (购于南京奥多尼福生物有限公司) , 小鼠抗BrdU单克隆抗体 (购于中杉金桥公司) , 藻红蛋白 (R-PE) 标记的CD45抗体, 异硫氰酸 (FITC) 荧光素标记的CD90抗体 (购于Invitrogen公司) , S-P试剂盒、胃蛋白酶、DAB显色试剂盒 (购于福州迈新公司) 。 1.2 方法 1.2.1 脑梗死灶造模和模型分析 按照Longa改良线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉闭塞 (middle cerebral artery occlusion, MCAO) 再灌注模型。大鼠苏醒后采用Longa 5分制评价造模是否成功。随机选取评分1～3分的大鼠脑行TTC染色, 并在后续试验中行HE染色来确定梗死灶。造模成功的大鼠随机分为对照组、BMSCs治疗组、BMSCs+VEGF治疗组, 各组10只, 分别于治疗1周和4周时处死大鼠, 每时间点处死5只。 1.2.2 细胞增殖和细胞级配对 取2月龄SD大鼠2只, 脱颈处死。75%酒精中浸泡5 min。无菌条件下分离出大鼠双侧股骨、胫骨。注射器抽吸培养液反复冲洗骨髓腔, 冲出骨髓细胞。冲洗液收集于离心管中, 1300 rpm/min离心5 min。弃上清液, 加入含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mM/L L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养液1 mL重悬骨髓细胞, 适度吹打制成单细胞悬液, 接种于10 mm培养皿内。37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度细胞箱内培养。培养3 d后第1次换液, 弃上清液, 除去非贴壁细胞, 同时更换新鲜培养液。根据细胞生长情况, 每3～5 d全量换液。细胞生长达80%～90%融合时, 消化传代。细胞悬液离心, 1300 rpm/min离心5 min, 倾倒上清液, 重悬细胞, 1∶2传代, 倒置相差显微镜下观察细胞形态。选第3代生长良好的细胞进行鉴定及后续实验。在第3代细胞接近90%融合时, 消化收集细胞, PBS洗涤2次, 取约1×106个细胞重悬于100 μL PBS中, 分别加入适量R-PE标记的CD45抗体和FITC标记的CD90抗体蔽光4 ℃下染色30 min。PBS洗涤2次, 加500 μL PBS重悬, 流式细胞仪检测分析。 1.2.3 brdu免疫细胞化学染色 将第3代的BMSCs消化离心, 以1×105/mL密度接种于新培养皿中, 待细胞50%左右融合时, 换用含10 μmoL/L BrdU的培养液继续避光培养72 h至细胞90%融合。PBS清洗2次后消化离心, 收集细胞进行后续的移植试验。同样密度的细胞用同样方法接种于爬片处理的6孔板中进行BrdU标记。72 h后爬片上的细胞用4%多聚甲醛固定, 用BrdU单克隆抗体, 采用SP法进行BrdU免疫细胞化学染色, 镜下观察标记率。随机记数10个非重叠视野 (×400) , 计算BrdU阳性细胞数占总细胞数的比例。 1.2.4 bmscs+vegf治疗 俯卧位, 颈部拱起, 后颈部剃毛、消毒。使用一次性BD注射器抽取用70 μL生理盐水重悬的BMSCs (已用BrdU标记) 1×106个, 以枕外粗隆和颈椎最高点的中点为穿刺点, 向两外耳道连线的中点方向进针。当针尖穿破环枕筋膜时, 有突破感, 回抽有