DB51T 2478-2018植物检疫实验室常规检验技术 病毒.docxVIP

ICS 65.020.01 B 16 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2478—2018 植物检疫实验室常规检验技术 病毒 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发 布 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 1 4 试剂与材料 1 5 仪器与用具 2 6 取样及送样 3 7 检测方法 3 8 结果判定 3 9 样品保存 3 附录A（资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症状特征 4 附录B（资料性附录） 李属坏死环斑病毒主要症状特征 5 附录C（资料性附录） 烟草环斑病毒主要症状特征 6 附录D（规范性附录） 酶联免疫吸附测定法检验程序 7 附录E（规范性附录） RT-PCR检验程序 9 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A、B、C为规范性附录，附录D、E为规范性附录，。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。 本标准起草人：万佳、宁红、邓亚岷、李刚、蒋辉、吴志平、郭迪金、李小松。 植物检疫实验室常规检验技术 病毒 1 范围 本标准规定了植物检疫实验室病毒检验的原理、试剂与材料、仪器与用具、取样及送样、检测方法、 结果判定和样品保存。 本标准适用于植物检疫实验室病毒的检验和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 15569 农业植物调运检疫规程 3 原理 病毒病一般根据病害症状很难确定病毒种类， 采用免疫学和分子生物学方法， 可快速根据有关判断 标准进行检验鉴定。 4 试剂与材料 4.1 DAS－ELISA 血清学检验试剂 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 a) 包被抗体：病毒抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于 4 ℃备用； b) 酶标抗体： 用碱性磷酸酶标记的病毒免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释， 贮藏于 4 ℃ 冰箱保存备用； c) 包被缓冲液：取 2.93 g 碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59 g 碳酸钠（Na2CO3） ，用 1000 ml 蒸馏水 溶解，pH 值为 9.6，贮藏于 4 ℃冰箱保存备用； d) PBST 洗涤液：取 1.15 g 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） 、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.2 g 无水磷 酸二氢钾（KH2PO4）、8.0 g 氯化钠（NaCl）、0.5 ml 吐温-20 ，用 1000 ml 蒸馏水溶解，pH 值为 7.2； e) 样品提取缓冲液：取 20 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2.0 g 蛋清蛋白、1.3 g 无水亚硫酸钠 （Na2SO3） 、0.2 g 叠氮化钠（NaN3）、0.5 ml 吐温－20、8 g 氯化钠、0.2 g 磷酸二氢钠、 1.15 g 磷酸氢二钠、0.2 g 氯化钾， 用 1000 ml 蒸馏水溶解，贮藏于 4 ℃冰箱保存备用；。 f) 共轭物缓冲液：取 0.2 g 牛血清白蛋白，用 100ml PBST 缓冲液溶解，贮藏于 4 ℃冰箱保存备 用； g) 底物：对硝基苯磷酸二钠； h) 底物缓冲液：取 0.1 g 氯化镁（MgCl2）、90.39 g 二己醇胺（CH2CH2OH）、19.82 g 二己醇胺 -HCl（CH2CH2OH-HCl）， 用 1000 ml 蒸馏水溶解，pH 值为 9.8，贮藏于 4℃冰箱保存备用； i) 终止液：12 g 氢氧化钠（NaOH）溶于 100 ml 蒸馏水。 4.2 RT-PCR 检验试剂 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 a) 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶： 100 U/μl； b) 1× TAE 缓冲液：40 mM Tris-HCl， 20 mM NaAc， 2 mM EDTA(用冰醋酸调 pH 至 8.0)。 c) 5× RT 缓冲液：50 mM Tis-HCl pH7.5， 100 mM NaCl， 0.1 mM EDTA， 10 mM DTT， 0.01% NP-40，50%甘油； d) 10× PCR 缓冲液： 100 mM Tris-HCl (pH 8.