DB51T 2685-2020猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法.docxVIP

ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2685—2020 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA） 检测方法 2020 - 7 - 14 发布 2020 - 8 - 1 实施 四川省市场监督管理局 发 布 目 次 前言 I 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 缩略语 1 4 仪器 2 5 耗材 2 6 试剂 2 7 样品采集和处理 2 8 CPA 操作程序 3 9 样品处理及生物安全管控措施 5 附录 A （规范性附录） 溶液配制 6 附录 B （规范性附录） 引物 7 附录 C （规范性附录） CPA 反应体系 8 前 言 本规范依据GB/T1.1-2009给出的规定进行编写。 本标准由四川省农业农村厅提出归口并负责解释。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准由四川省动物疫病预防控制中心、四川纳比生物科技有限公司负责起草。 本标准主要起草人：陈斌、周明忠、陈弟诗、袁旦一、李晓琪、裴超信、张毅、邓飞、李丽、邵靓、 陈冬、蔡冬冬、丁梦蝶、邱明双、周莉媛、张睿、辜良斌。 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA） 检测方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒的交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法。 本标准适用于四川省行政区域范围内猪伪狂犬病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 25172-2010 猪常温精液生产与保存技术规范 SN/T 3567.1-2013 交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分： 通用技术规程 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 CPA 交叉引物恒温扩增（Crossing Primming Amplification） 3.2 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribomucleicacid） 3.3 Bst 酶 Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase） 3.4 TE 缓冲液 Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTA buffer） 3.5 PRV 伪狂犬病毒（pseudorabies virus） 3.6 PBS 磷酸盐缓冲液 4 仪器 4.1 恒温金属浴。 4.2 高速台式冷冻离心机。 4.3 组织研磨仪或研钵。 4.4 普通冰箱： 2℃~8℃。 4.5 普通冰柜： -20℃以下。 4.6 超低温冰箱：可控温至-70℃。 4.7 微量移液器：0.2μL～2.5μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL，并配备与移液器匹配 的吸头。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 干烤灭菌器。 4.10 普通 PCR 仪。 5 耗材 5.1 1.5mL 离心管。 5.2 0.2mLPCR 薄壁管或八连管。 5.3 PCR 管漂浮板。 6 试剂 6.1 除非另有说明， 在检测中使用的试剂均为分析纯， 实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 6.2 DNAzol 于 2℃-8℃保存；商品化 DNA 提取试剂按说明书要求条件保存。 6.3 无水乙醇， -20℃预冷。 6.4 75%乙醇， 无水乙醇和双蒸水配制， -20℃预冷。 6.5 8mmol/LNaOH 溶液， 配制见附录 A。 6.6 PBS 缓冲液， 配制见附录 A。 6.7 Bst 酶及 Bst 酶反应缓冲液：Bst 酶浓度为 8U/μL，Bst 酶反应缓冲液为 10×Thermopol* Buffer，Mg2+ 浓度为 100mmol/L。 6.8 dNTP Mix：含 dATP 、dGTP 、dCTP 、dTTP 各 10mmol/L,-20℃保存， 避免反复冻融。 6.9 引物序列参见附录 B。 6.10 伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒， -20℃保 存备用；阴性对照可采用 ddH2O。 6.11 石蜡油，按说明书要求条件保存。 7 样品采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 手术刀、剪刀、镊子，经 160℃干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。 7.1.2 一次性无菌棉拭子。 7.1.3 组织研磨器或者研钵，经 160℃干热灭菌 2h 或