DNA甲基化检测概念.pptxVIP

DNA甲基化的检测方法 1.DNA甲基化检测的基本原理 目前文献报道的各种DNA 甲基化分析方法均依赖于三种 基本原理 ， 它们分别是： ➢ 甲基化敏感性限制性核酸内切酶（MSRE） 分析方法 ➢ 对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 ➢ 用甲基CpG 结合蛋白分离甲基化的DNA 1.1 甲基化敏感性限制性核酸内切酶分析方法 此类方法主要是利用部分甲基化敏感性限制性 核酸内切酶(MRSE) 所识别的DNA序列如果被甲基 化则不能切割这一序列。 利用这一特性 ， 对基因组DNA 进行酶切后 ， 再采用一些方法对酶切后基因组DNA 进行检测 ， 即可明确所检测位点的甲基化状态 在DNA 单链中 ， 未甲基化的胞嘧啶在高浓度的重亚硫 酸盐作用下经一系列化学反应后可转化成尿嘧啶（U） ， 而 5mC 则保持不变 。在随后的PCR 过程中 ， 尿嘧啶（U） 被转 换为胸腺嘧啶（T） 。如此就将胞嘧啶的甲基化修饰这种化 学修饰信息转化为序列差异信息。 1.2对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫 酸盐转化 1.3.用甲基CpG 结合蛋白分离甲基化的DNA 利用甲基CpG 结合蛋白（MeCP） 可以结合DNA中的甲基 CpG的性质 ， 以MeCP 为填充物开发的MBD 柱层析 法可将基因组范围内的甲基化DNA片段分离出来 ， 再结合前 两种原理可对全基因组范围内的甲基化位点进行扫描 2.DNA甲基化检测的方法 基于以上的每一种原理均可开发出多种方法 ， 每种方法都 有其优缺点及适用范围 。常用方法有： ➢ 甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增（MS-MLPA） ➢ 甲基化特异性PCR（MSP） ➢ 重亚硫酸盐测序 这是一种基于MSRE 的分析方法 ， 该 方法要求所检测的CpG 位点位于某 一特定的MSRE 识别序列内 ， 如Hha Ⅰ所识别的GCGC 。针对该位点设计 两条探针 ， 上游探针的3 ′端位于该 位点5 ′端1 个碱基处 ， 下游探针5 ′ 端位于该位点3 ′端1 个碱基处 。上 游探针的5 ′端和下游探针的3 ′端 含有一套公用PCR 引物序列 。针对 不同位点的探针长度可有不同 。将 探针与模板DNA 杂交后 ， 加入连接 酶进行连接反应 ， 并加入相应的 MSRE 如HhaⅠ 。若该位点甲基化， HhaⅠ不能切割 ， 则模板保持完整 ， 随后的PCR 反应可以进行 ， 若未甲 基化 ， HhaⅠ将连接反应形成的模板 DNA切割 ， 随后的PCR 反应不能进行。 2.1 甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩 增（MS-MLPA） 2.2甲基化特异性PCR（MSP） • 基本原理是当用化学试剂重亚硫酸盐处理样品时 ， 所有未 被甲基化的胞嘧啶C将发生脱氨基作用 ， 变为尿嘧啶U； 而甲基化的胞嘧啶则不发生改变。 • 该技术主要对CpG岛甲基化情况进行分析 。 甲基化和未甲 基化的样品被处理后 ， 其碱基序列将不再相同 。据此分别 设计甲基化引物和非甲基化两对引物去扩增 ， 重硫酸盐处 理后的模板 ， 以是否能得到相应的PCR产物确定甲基化情 况。 • 若仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物 ， 则该片段高度 甲基化； 若仅能用非甲基化引物得到预期的PCR产物 ， 则 该片段未发生甲基化 。若两对引物均能得到阳性PCR产物， 则说明该片段部分甲基化。 染色体DNA的 亚硫酸盐处理 技术路线 PCR扩增 ， 得 到结果 染色体DNA的 制备 引物的设计 2.3重亚硫酸盐测序 • 1.待测DNA样品用限 制性内切核酸酶或超 声波破碎处理打断成 500-1000bp碎片 • 2.重亚硫酸盐处理碎 片： 未甲基化C脱氨 基转变成U ， 甲基化C 被保护不变 • 3.PCR扩增、克隆 • 4.设计测序引物 ， 进 行测序（U被读成T） • 5.参考原始序列判断 原C位点是否甲基化 方