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高效毛细管电泳法测定人血浆中班布特罗及其代谢物特布他林血药浓度 盐酸萘是一种新型的长效2受体激动剂，适用于气管哮喘、慢性支气管炎、气短等疾病。本品为特布他林的二氨基甲酸酯前体药物,盐酸班布特罗本身无活性,口服后在体内被血浆丁基胆碱酯酶水解成特布他林(terbutalin)而产生疗效,一天一次给药后,能产生稳定、持久的特布他林血药浓度24 h以上。 高效毛细管电泳具有高效、快速、进样量少、节省试剂等特点,但毛细管内径小、检测光程短,限制了检测的灵敏度,本文采用区带毛细管电泳用电迁移场放大进样测定班布特罗及其代谢物特布他林的血药浓度,提高了灵敏度,方法简便,可做为班布特罗药代动力学及生物等效性研究中的有效分析方法。 1 药品、试剂与标准品 美国Beckman公司P/ACE system 5000高效毛细管电泳系统及紫外检测器,P/ACE工作站,Beckman公司未涂渍的熔融石英毛细管(75 μm×67 cm,有效分离长度50 cm),BAKEN 12管真空固相萃取装置,Bond-Elut SPE小柱(C18100 mg,1 mL)。 盐酸班布特罗片剂(每片10 mg)及对照品(纯度:99.8%)由瑞典阿斯特拉制药有限公司提供。特布他林对照品(纯度:99.9%)购自中国药品生物制品检定所。内标物:普萘洛尔由英国ZENECA制药有限公司提供。毒扁豆碱标准品由上海医药采购供应站提供。甲醇为色谱纯,水均为重蒸馏水,磷酸二氢钠、磷酸为分析纯。 2 试验条件和方法 2.1 细管活化和分析 运行缓冲液:80 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(用磷酸调pH=3.15),使用前用0.45 μm滤膜过滤并用超声波脱气。毛细管活化用1 mol·L-1盐酸、0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液、水、运行缓冲液各冲洗5 min。2次分析之间用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液、水和缓冲液各冲洗1 min。进样条件:检测波长200 nm,进样电压10 kV,运行电压25 kV,进样时间10 s(低浓度30 s),温度20 ℃,进样前在毛细管内注入1个短的稀缓冲溶液塞(气压进样5 s),电泳时间15 min。 2.2 对照品贮备液的制备 班布特罗对照品溶液:精密称取班布特罗对照品20.0 mg,置于100 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得200 mg·L-1的对照品贮备液。取上液1 mL置于100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,得2 mg·L-1的对照品溶液。 特布他林对照品溶液:精密称取特布他林对照品50.0 mg,置于100 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得500 mg·L-1的对照品贮备液。取上液1 mL置于100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,得5 mg·L-1的对照品溶液。 毒扁豆碱溶液:称取适量毒扁豆碱标准品,用0.9%氯化钠溶液溶解并摇匀,得1 mmol·L-1毒扁豆碱溶液。 以上各溶液均置4 ℃冰箱保存备用。 2.3 淋洗脱去耐水剂 取血浆样品1 mL加普萘洛尔内标溶液10 μL,混匀,固相萃取小柱(C18100 mg,1 mL)分别用甲醇2 mL、水1 mL活化后,上样,抽滤,分别用水1 mL,5%甲醇1 mL淋洗,淋洗液弃去,再用甲醇1 mL洗脱,收集洗脱液,直接进样。 3 结果 3.1 内标普、班布他林、班布特罗的保留时间 在选定的电泳条件下测得的电泳图见图1。由图1可见,血浆中内标普萘洛尔、特布他林、班布特罗的保留时间分别为10.4,10.8,12.4 min,各峰分离良好,且血浆组分对主峰无干扰。 3.2 特布他林浓度 将2 mg·L-1班布特罗对照品溶液80 μL及5 mg·L-1特布他林对照品溶液80 μL加入干净试管中,加入空白血浆至10 mL使班布特罗浓度为16 μg·L-1,特布他林浓度为40 μg·L-1,用空白血浆依次对半稀释使班布特罗浓度为8,4,2,1,0.5,0.25,0.125 μg·L-1;特布他林浓度为20,10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125 μg·L-1。按上述方法处理后进样测定,由样品峰面积与内标峰面积的比值A对浓度C(μg·L-1)进行线性回归,得班布特罗及特布他林回归方程(n=5)分别为: A=5.29×10-4+2.87×10-3C r=0.997 6 A=2.69×10-3+5.90×10-3C r=0.999 7 线性范围分别为16~0.125 μg·L-1及40~0.3125 μg·L-1,最低检测浓度分别为0.1 μg·L-1及0.3 μg·L-1。 3.3 方法学评价 3.3.1 萃取回收率测定 将2 mg·L-1班布特罗对照品溶液80 μL加入干净试管中,加入空白血浆至10 mL制成16 μg·L-1的对照品血浆,用空白血浆稀释成