基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性快速评价方法.pdfVIP

基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性快速评价方法 1 范围 本文件规定了基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性评价的方法原理、受试物、仪器设备、试验准备、 试验步骤、保证试验有效性的条件、判定步骤、数据处理与试验报告等内容。 本文件适用于基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性的评价。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 斑马鱼 zebrafish 模式动物的一种，常用于教学和科研。生物分类学上属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、 斑马鱼属、斑马鱼种。 3.2 Tg （cmcl2:EGFP）品系转基因斑马鱼 Tg （cmcl2:EGFP） strain transgenic zebrafish 实验室常用斑马鱼品系，心脏被绿色荧光标记。 3.3 仔鱼 larva 性腺发育尚未成熟的斑马鱼。 3.4 受精后小时数 hours post-fertilization （hpf） 斑马鱼胚胎体外受精后的小时数。 3.5 10 %致死浓度 10% lethalconcentration （LC ） 10 受试物导致10%受试鱼死亡的浓度。没有心跳判定为死亡。 3.6 心率 heart rate 心脏每分钟搏动的次数。 3.7 SV-BA距离 SV-BA distance SV-BA 距离是指静脉窦 （SV）和动脉球 （BA）之间的距离。 3.8 心室短轴缩短率 ventricular fractional shortening （FS） 心室短轴缩短率 （FS ）＝ ［心室舒张末期内径 （Dd）－心室收缩末期内径 （Ds）］/ Dd。 3.9 射血分数 ejection fraction 每搏输出量占心室舒张末期容积的百分比，称为射血分数。 3.10 每搏输出量 stroke volume 舒张末期容积与收缩末期容积之差，即为每搏输出量。 3 4 方法原理 斑马鱼的心血管系统在解剖结构和生理功能方面与哺乳动物相似，心脏由心房和心室构成，房室之 间存在瓣膜，且其心脏的发育及基因调控机制等也与人类相似。受精后48h，静脉窦、心房、心室发育 完成，心脏通过舒缩实现泵血功能。斑马鱼胚胎通体透明，心脏形态和心跳可在显微镜下直接观察，可 快速、无创获取斑马鱼心率、心包面积、SV-BA距离、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量等心功能评 价相关指标。因此，以斑马鱼为试验动物，应用荧光显微成像等技术，以心率、心包面积、SV-BA距离、 射血分数、短轴缩短率、每搏输出量等为检测指标，可对药物的早期心脏毒性进行快速定量分析。 5 受试物 5.1 受试物配制 5.1.1 水溶性药物：斑马鱼培养水直接溶解配制成检测溶液。 5.1.2 非水溶性药物：选用有机溶剂、乳化剂或分散剂等进行助溶，制备成均匀分散的悬浊液或乳浊 液。 5.2 受试物准备量 5.2.1 固态受试物检测用量10 mg～50 mg。 5.2.2 液态受试物检测用量30 mL～50 mL。 5.2.3 半固态受试物检测用量20 mg～100 mg。 5.2.4 半液态受试物检测用量20 mL～100 mL。 5.3 受试物相关信息 5.3.1 受试物的名称、性状、批号、规格、生产日期、保存条件、保质期。 5.3.2 受试物为单体成分时，还需要提供该成分相应的化学信息，包括分子量、分子式、分子结构。 5.3.3 提供受试物理化性质，包含如下信息： a) 在水中或其它溶剂中的溶解性； b) 在水中和光中的稳定性； c) 温度对受试物稳定性的影响。 6 仪器设备 6.1 分析天平。精度0.0001g。 6.2 体视荧光显微镜。 6.3 图像采集系统。 6.4 恒温光照培养箱。精度±1℃。 6.5 斑马鱼养殖系统。配备温控装置，水循环和过滤装置。 6.6 水质监测设备。pH计、溶解氧测定仪、盐度计。 6.7 试验容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受试物可能吸附于聚苯乙烯容器时，应选用惰性材料 （如玻 璃）来减少吸附。 7 试验准备