2型糖尿病大鼠模型的建立及肾脏病变特点.docxVIP

2型糖尿病大鼠模型的建立及肾脏病变特点 在国外，2型糖尿病占所有糖尿病的85%95%。根据中国的报道，这一比例超过90%。因此,研制2型糖尿病的动物模型对其发病机制及其慢性并发症的研究具有重要意义。我们通过高糖高脂饮食,结合小剂量链脲佐菌素(STZ)注射的方法制备了一个新的2型糖尿病大鼠模型,其发病过程及特征与部分患者的临床过程及代谢特征类似,并具有2型糖尿病肾病的典型特点。 材料和方法 一、 测定试剂和动物 STZ、戊巴比妥钠、胰岛素、生长抑素(somatostatin)购自Sigma公司,胆固醇购自南京生化制药厂,PE20购自Becton Dickinson公司,葡萄糖测定试剂盒购自上海科欣生物技术研究所,血浆胰岛素测定试剂盒购自法国CIS公司,蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad公司。 清洁级近交系雌性4周龄Wistar大鼠,体重180～190 g,购自中科院上海实验动物中心。每笼5只,饲养于标准环境,自由进饮食,12 h光照周期。 二、 模型组的计算 大鼠喂以高糖高脂饲料(饲料组成:10.0%猪油,20.0%蔗糖,2.5%胆固醇,1.0%胆酸盐,66.5%常规饲料),以诱导出胰岛素抵抗。高糖高脂饮食1个月后,模型组腹腔注射25 mg/kg STZ;对照组仅注射枸橼酸缓冲液。 三、 灌注条件及输注效果 参照文献方法并改良。实验时,大鼠禁食过夜。以1%戊巴比妥钠按20 mg/kg剂量麻醉,在大鼠右颈动脉和左颈静脉分别置入PE20导管。在大鼠清醒并可以自由活动状态下,以微量注射仪(浙江医科大学医学仪器厂)从颈静脉按20 μl/min速度持续灌注葡萄糖[0.22 mmol/(kg·min)]、胰岛素[30 nmol/(kg·min)]和生长抑素[920 pmol/(kg·ml)]共150 min。灌注液以0.5% BSA生理盐水配制。于灌注90、120和150 min时从颈动脉取血标本3次,每次300 μl。在上述实验条件下,持续灌注30～60 min后,血中葡萄糖及胰岛素水平达到稳态平衡。以灌注90、120和150 min时3点血糖及胰岛素平均值作为稳态血糖(steady-state plasma glucose, SSPG)、稳态胰岛素(steady-state plasma insulin, SSPI)值,以衡量胰岛素敏感性的程度。 四、 血糖、血浆胰岛素测定 血标本采集时间通常在上午10点钟以后,于1%戊巴比妥麻醉下(30 mg/kg)从眼内眦静脉获取,EDTA抗凝。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法。血浆胰岛素测定采用CIS(法国)放免(竞争法)试剂盒。血甘油三酯、胆固醇测定于日立自动生化仪上进行。 五、2 标准差与胰岛素敏感性 空腹血糖大于正常大鼠血糖均值+3个标准差(本研究确定该值为140 mg/dl);胰岛素敏感性降低。符合此标准的大鼠确定为2型糖尿病大鼠。 六、 肾组织病理学检查 取大鼠肾脏后,去除包膜,长轴方向对切。用10%中性甲醛固定后,石蜡包埋切片,切片厚度1 μm。切片作常规HE染色和PAS染色。 七、 数据分析 所有数据以xˉ±sxˉ±s表示。2组间比较采用t检验。 结果 一、 两组高胰岛素血糖、血糖变化情况 与常规饲料喂养大鼠(n=30)相比,高糖高脂饮食大鼠(n=90)在高糖高脂饮食后1个月,24h摄食量、体重明显增加;血甘油三酯、胆固醇水平也增加明显,比常规饲料组高出2倍以上,并发生了高胰岛素血症,其水平几乎是常规饲料组的2倍;血糖也比常规饲料组明显增高,但尚未达到糖尿病标准。高糖高脂饮食已成功诱发出胰岛素抵抗(表1)。 二、 不同高糖高脂饲料对大鼠血糖、血糖的影响 高糖高脂饲料喂养大鼠(high-sucrose and high-lipid/STZ, n=70)在注射25mg/kg STZ后,诱发出程度不同的高血糖症。在注射STZ后1周,血糖平均为290mg/dl,其中轻度增加(140～200mg/dl)者占13%,中度增加(200～400mg/dl)者占据40%,重度增加(400mg/dl)者占29%,另外有19%大鼠血糖低于140mg/dl,但仍高于其他各组。在注射STZ后4周,大鼠血糖有轻微下降,平均为280mg/dl,其中轻度增加者占20%,中度增加占据30%,重度增加占27%,另有23%低于140mg/dl的糖尿病标准。 对血糖程度不同的高糖高脂饲料喂养加STZ注射组大鼠血胰岛素水平进行分析,结果显示:轻度血糖增加者血胰岛素为22.4mU/L,中度增加者为17.8mU/L,重度增加者为13.5mU/L。常规饲料组大鼠的血胰岛素为16.9mU/L。从整体上来看,高糖高脂饲料喂养加STZ注射组与常规饲料组大鼠血胰岛素水平无明显差异。 另外,在STZ注射后4周,高糖高脂饲料喂养加STZ注射组表现为