基因工程基因工程的载体.pptVIP

启动子：影响表达效率的主要因素之一是启动子的强弱. 启动子的强弱取决于启动子本身的序列，尤其是—10和—35区的碱基组成及彼此的间隔长度，同时也与启动子和外源基因转录起始位点间的距离有很大关系。 复制子：一段包含复制起始位点的DNA片段。 * 本文档共176页；当前第157页；编辑于星期六\2点20分 (1) 启动子 启动子 -35 区序列 -10 区序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lL T T G A C A G A T A C T P recA T T G A T A T A T A A T * 本文档共176页；当前第158页；编辑于星期六\2点20分 最佳启动子具备的条件 第一 必须是强启动子 第二 启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平 第三 启动子应是诱导型的（热或化学诱导） * 本文档共176页；当前第159页；编辑于星期六\2点20分 (2) 终止子 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA 操纵子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终 止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。 * 本文档共176页；当前第160页；编辑于星期六\2点20分 (3) 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） * 本文档共176页；当前第161页；编辑于星期六\2点20分 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合，将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子 大肠杆菌绝大部分基因以 AUG 作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 ； SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列 (3) 核糖体结合位点 * 本文档共176页；当前第162页；编辑于星期六\2点20分 (4) 密码子 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。 生物体对密码子的偏爱性 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。 构建Ecoli.表达载体时要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当调整。 * 本文档共176页；当前第163页；编辑于星期六\2点20分 * 本文档共176页；当前第164页；编辑于星期六\2点20分 * 本文档共176页；当前第165页；编辑于星期六\2点20分 * 本文档共176页；当前第166页；编辑于星期六\2点20分 表达载体类型: Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体） * 本文档共176页；当前第167页；编辑于星期六\2点20分 三种表达型载体结构图 * 本文档共176页；当前第168页；编辑于星期六\2点20分 (一)原核表达载体 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体 1.原核表达载体的表达元件 启动子 转录终止子 核糖体结合位点（SD序