基因工程实验.docVIP

本实验课程以一个基因片段的获得,表达和纯化和活性分析为主线,抓住蛋白和核酸两大主题,建立一个综合型和研究性的大实验教学体系,重视各项技术的衔接,启迪学生的科学思维和创新意识,提高学生对实验方法和实验技术的综合运用能力 课程设计的思路： 实验一、E.coli染色体DNA提取 实验原理：①溶菌酶破壁②蛋白酶K水解③菌体核蛋白变性④染色体DNA沉淀 〔氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的别离〕 实验步骤：1. 收集菌体: 1ml菌液/2人, 5k, 5?,弃上清。2. 加0.5ml Buffer A,振荡混匀。3. 加50?l10% SDS至终浓度1%,混匀。4. 加5?lProK至终浓度0.1mg/ml,55℃保温1h。5. 加等体积PCI,混匀,12k, 5?。6. 加等体积氯仿,12k, 5? 7. 加0.8V异丙醇,冰浴30?,12k, 5?。8. 70%Eth洗涤沉淀, 12k, 5?。9. 枯燥后溶于20?lTE,?20℃保存 考前须知：①Tris-饱和酚的使用②防止剧烈振荡③EP管的使用 〔酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时,蛋白分子之间的水分子就被酚-氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白的密度比水的密度大,因而与水相别离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚-氯仿有机溶剂比重更大,保存在最下层. 作为外表