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谷氨酰胺合成酶活性测定 原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和 M g 2+ 存在下， 它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟 酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成 量来表示，单位 μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用 540nm 处吸光值的大小来表示， 单位A· mg －1 protein·h －1 。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵； 恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0， 内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tri（s 三羟甲基氨基甲烷）1.5295g， 0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和 34.25g 蔗糖，去离子水溶解后， 用 0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至 250ml； 反应混合液 A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲， pH7.4）： 内含 80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和 2 mmol/L EGTA，称取 3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 · 7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用 0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至 250ml； 反应混合液 B（含盐酸羟胺，pH7.4）： 反应混合液A 的成分再加入 80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和 0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加 5ml 浓盐酸，定容至 100ml； 40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于 5ml 去离子水中（临用前配制）。 【方法】 1.粗酶液提取称取植物材料 1g 于研钵中，加 3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃ 下 15,000g 离心 20min，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液 B，加入 0.7ml 粗酶液和 0.7ml ATP 溶液，混匀，于 37℃下保温半小时，加入显色剂 1ml，摇匀并放置片刻后， 于 5,000g 下离心 10min，取上清液测定 540nm 处的吸光值，以加入 1.6ml 反应混合液 A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液 0.5ml，用水定容至 100ml，取 2ml 用考马斯亮蓝 G-250 测定可溶性蛋白质（见实验 28）。 4.原始数据记载 5.结果计算： GS活力(A·mg －1 protein·h －1 )＝ 式中 A—540nm 处的吸光值； P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T—反应时间（h）。