目的基因克隆.docx

目的基因的克隆 摘要 基因克隆是经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。本实验以水稻基因为模 板，通过PCR扩增出1.0bp左右的片段，用SacI、KpnI将片段进行双酶切，与pUC18 载体连接获得重组子，将其转化到大肠杆菌感受态细胞中并提质粒酶切验证进行筛选 鉴定。 关键词：基因克隆；扩增；连接；转化；酶切 1引言 蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在植物细胞感受 各种环境信号及其信号传导与放大过程中起着重要作用，其中促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的作用受到广泛重视。本实验旨在筛选并鉴 定出水稻MAPK的阳性克隆。 2材料与方法 2.1实验材料 2.1. 1试剂和缓冲液 Tag 酶，10XPCR Buffer，dNTPs，弓I物，模板，琼脂糖，漠酚蓝，TE，TAE，EB， DNA marker，质粒，SacI，KpnI，无菌水，乙醇，NaAc，T4 连接酶，E.coli，CaCl2 (灭 菌)，LB固液体培养基，氨苄青霉素(Amp)，溶液I，溶液II，溶液III，70%乙醇。 2.1.2仪器耗材 PCR仪，掌上离心机，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒，电泳仪，电泳槽，凝 胶成像仪，移液枪一套，微波炉，水浴锅，灭菌锅，Tip，eppendorf管，控温摇床 (37°C)，冷冻离心机，冰箱(-20T、-70°C)，超净工作台，培养箱(37°C)，分光光 度计，三角瓶，6cm平皿，酒精灯，三角玻棒，酒精棉球，火柴，制冰机，试管，培 养皿，试剂瓶，超净工作台。 2.2实验方法 2.2.1目的基因的获得 按如下反应体系加入下列各成分: 模板 DNA (5ng/gL) 0.5 gL Primer1 0.3 gL Primer2 0.3 gL 10XPCR buffer 1.5 gL dNTPs (2.5mmol/L) 1.2 gL Taq 酶(5U/gL) 0.3 gL ddH2O 10.9 gL 总体积为15p L,混匀后，加入10p L石蜡油覆盖，然后按以下程序进行扩增: 94 C 2 min 94 C 0.5 min 60 C 0.5 min 28 cycles 72 C 1 J 1 min 72 C 8 min 4C hold 反应结束后取出PCR反应管，纯化PCR产物（将PCR产物加入H O补足体积至 2 100. L，然后加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）溶液，再加2倍体积的无水 乙醇，-20°C，沉淀DNA。12000 rpm/min 4°C离心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉 淀物，再离心，弃上清，干燥加10 M LddHO溶解）的同时用1%的琼脂糖凝胶电泳检 2 测PCR产物（取PCR产物2. L与上样缓冲液混合，点样），电泳结束后，漠化乙锭染 色5-10分钟，用凝胶成像仪观察、拍照。 2.2.2载体和目的片段的酶切 2.2.2.1载体和外源DNA的酶切 按如下反应体系加入下列各成分： 反应体系1 2 gL5 gL0.5 gL 2 gL 5 gL 0.5 gL 0.5 gL buffer SacI (10U/gL) Kpnl (10U/gL) TOC \o 1-5 \h \z ddH2O 42 应 反应体系2 PCR 产物(50ng/pL) 10 应 buffer 10 gL SacI (10U/gL) 0.5 gL Kpnl (10U/gL) 0.5 gL ddH2O 79 gL 37°C酶切2至4个小时，65°C, 10分钟终止反应。 2.2.2.2电泳检测 取10gL质粒载体酶解液，电泳检测。PCR产物酶切后不必电泳检测，直接回收 即可。 2.2.2.3酶切片段的纯化及回收 将酶解液加入H2O补足体积至100gL，然后加入1/10体积的3mol/L的NaAc (pH5.2)溶液，再加2倍体积的无水乙醇，-20C，沉淀DNA。12000 rpm/min 4C离 心15min，弃上请，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，弃上清，干燥加4 gLddH2O溶解。 2.2.3 DNA重组技术 质粒酶切产物 4 PCR酶切产物 4 TOC \o 1-5 \h \z T4 ligase 1 10xbf 1 H2O 3 Total 10 gL 16C连接 4-5h。 2.2.4大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化 2.2.4.1感受态细胞制备 第一天：从大肠杆菌TOP10平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基 的试管中，37°。振荡培养过夜。 第二天：取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37°C 振荡培养。2-3 h，测定OD600 M 0.4-0.5，细胞数务必＜1