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大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化-实验报告

大肠杆菌，是一种伴随我们终生的细菌，也是生物实验常用的模式生物。通过感受态细胞的制备和宿主细胞的转化等操作实现基因工程改造，大肠杆菌便成为基因工程菌，并造福人类。本期科创科普就让我们一起来了解相关的实验操作及原理吧！

10000X大肠杆菌电镜图

Part01

大肠杆菌感受态细胞的制备

如果我们直接将外源DNA和宿主细胞放在一起，由于细胞膜具有选择透性，外源DNA无法穿过细胞膜进入宿主细胞。因此我们需要制备感受态细胞，改变细胞膜结构，增加其通透性，然后才可以进行外源DNA的导入。

在本次介绍中，我们采用最常见的CaCl2法进行感受态细胞的制备。

大肠杆菌感受态细胞图[1]

CaCl2法的优缺点及原理

优点：操作简单,重复性好。

缺点：影响因素较多,若不注意细节和条件实验容易失败。[2]

Ca2+改变细胞膜通透性的原理：非生理条件的Ca2+浓度下，一方面，高浓度的Ca2+聚集在细胞表面改变细胞壁的渗透性，使外源DNA更易接近细胞膜；另一方面，少量Ca2+进入细胞，可在细胞膜上形成新的通道，为外源DNA进入细胞提供条件。[3]

实验步骤

大肠杆菌感受态细胞制备实验步骤图

这个实验看起来简单重复；其实不然，感受态细胞的制备有很多影响因素，哪怕只是浓度的些许差别，都可能使转化效率下降几个数量级。

影响大肠杆菌感受态细胞制备的因素

Ca2+终浓度：Ca2+终浓度是维持细胞膜通透性的关键因素。当Ca2+浓度在100mmol·L-1时，质粒的转化率最高，而大肠杆菌摄取DNA的能力不受转化前是否经过Ca2+处理的影响。[2]

数据来源[4]

CaCl2的灭菌方式：不可采用高温灭菌法，高温灭菌法并不能有效除去杂质，反而会使溶剂减少，形成沉淀物，影响溶液的pH值；应采用过滤灭菌法，可避免上述缺点。[1]

大肠杆菌的生长状态：其理想状态是处于对数生长早期，生长过度或者发育不全的细菌制备感受态细胞的转化率都较低。[2]

离心速度和时间：经过CaCl2处理后的大肠杆菌处于膨胀状态，过快过久的离心会损伤细胞。[2]

More：除了CaCl2法，还有TSS法、甘油-聚乙二醇法、电转化技术、超声波转化，前两种为化学法，后两种为物理法。感兴趣的同学可以自行了解。

Part02

受体细胞的转化

感受态细胞制备完成后，接下来是质粒的导入和相应性状的表达。

EGFP（绿色荧光蛋白）的介绍

明明有这么多荧光蛋白，为什么我们选择GFP呢？

绿色荧光蛋白于1962年被日本科学家下村修发现并分离，是最早被发现的荧光蛋白，因此它是最为我们所熟悉的一种荧光蛋白。

当然，GFP的优点不止这一个，现在有了加强版EGFP，让其荧光更加明显。而其他的荧光蛋白会有光谱重叠，普通的荧光显微镜不易看清。所以我们选择使用EGFP。

实验步骤以及现象的观察

五步教你轻轻松松导入质粒

冰浴→热激→冰浴→复苏→涂布培养

Q1：为什么采用冷热交替的方式？

A1：细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，大肠杆菌会膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（因为DNase会消化外源DNA，所以形成抗DNase的物质有利外源DNA的生存），从低温突然提高到42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量可改变细胞膜通透性的cAMP，促使细胞吸收外源DNA，从而大大提高转化率。

Q2：如何看到绿色荧光？

A2：取大肠杆菌培养液，离心，弃上清液，无菌水洗涤后置于载玻片上，可用荧光显微镜在紫外光下进行镜检。[5]

当然，在紫外光下，表达了绿色荧光蛋白的单菌落也会发出肉眼可见的绿色荧光。

荧光显微镜下大肠杆菌细胞团[6]

紫外光下大肠杆菌单菌落

大肠杆菌的转化实验是一个经典的标准实验，通过本期科创科普，相信大家都对感受态细胞的制备和受体细胞的转化实验有了一定了解。

本期的科创科普就到这里啦，我们下期再见。

参考文献：

[1]谢志雄,陈向东,李文化,沈萍,庞代文.大肠杆菌HB101感受态细胞的嫌我观察与分析.武汉大学学报(理学版),2002,(02),253-256+132

[2]郭梦桃,吴靖芳.大肠杆菌感受态细胞制备及转化研究现状.河北北方学院学报(自然科学版),2020,36(08),44-48

[3]李文化.Ca2+诱导对大肠杆菌摄取外源DNA的研究.[D].武汉,武汉大学生命科学学院.2004,04

[4]梅运军,陈向东,谢志雄,沈萍,李文化.Ca2+对诱导大肠杆菌摄取外源DNA的影响武汉大学学报(理学版),2012,58(04),354-358DOI:10.14188/j.1671-8836.2012.04.018

[5]赵仲麟,袁超,朱伟,苏同福,潘振良,金显春.化学生物学综合创新设计实验——大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白