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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
Polyacrylamidegelelectrophoresis
实验原理
采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。（参看理论部分）
仪器设备
1.电泳玻管内径0.5cm，长12cm
小胶管、玻棒直径0.7—0.8cm,长1.5—2cm
.玻璃滴管、吸管、毛细滴管（灌胶用）
.微量加样器（50u1）（上样用）
.桑玻氏管或灯泡瓶
.真空泵
.滤纸、剪刀
.电泳槽、青霉素瓶塞（有孔）、竹筒
.电泳仪（50mA、400V以上）
.注射器（5m1）和长针头（剥胶用）
11.培养皿
试剂
1.丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）：一般可用分析纯（或标准纯）的Acr利Bis,无需进一步提纯。但工业用的Acr利Bis必需提纯或重结晶后才能应用。
Acr的重结晶：将Acr溶于50°C氯仿中（70克/升），趁热过滤，冷却至-20°C结晶，冷却的布氏漏斗过滤收集结晶，用冷氯仿淋洗，将结晶真空干燥。
纯化的Acr水溶液的pH值在4.9?5.2,只要pH变化不大于0.4pH单位，就可使用。必要时可反复重结晶。
Bis重结晶：12克Bis溶于40?50C丙酮1升中，趁热过滤。凉后置-20C结晶，过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤，真空干燥。
Acr和Bis的贮存：固体Acr和Bis应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、Y-辐射和自然光的照射，（因可引起Acr自身聚合而失效）。Acr和Bis贮存液，由于水解生成丙烯酸和NH3而失效，贮存于4C冰箱可延缓水解，但也只能保存1—2月。
Acr利Bis是神经性毒剂，同时对皮肤有刺激作用。操作时应予以注意防护，大量操作（如纯化）时应在通风柜中进行，并避免吸入尘埃。
2.TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。
.过硫酸铉（不能潮解，否则不能用）
.染色液：用0.05NNaOH配制0.1%漠酚兰液
.洗脱液：7%醋酸
.其他试剂：见下表贮存液的配制
按表1配制各贮存液置冰箱中贮存，可放1—2月（但过硫酸铉液贮存冰箱不能超过一周）。
表1贮存液及工作溶液的配制
贮存液
100m1溶液中的含量
PH
工作溶液配制的体积比
1NHC1
48.Oml
分离胶制备：
1
Tris
36.6克
1份1号，2份2号，1份
TEMED
0.23ml
8.9
水；
2
Acr
28.0克
抽气后加入4份3号
Bis
0.725克
凝胶浓度7%
3
过硫酸铉0.14克
1NHCl48.Oml
Tris5.98克
pH8.9
浓缩胶制备：
4
TEMED0.46ml
Acr10.0克
6.7
1份4号，2份5号
抽气后加入4份6号
5
Bis
2.5克
凝胶浓度2.5%
pH6.7
6
蔗糖40.0克
电泳槽缓冲液：
用时可稀释10倍
7
实验操作
Tris0.60克
甘氨酸2.88克
8.3
500ml可供12根电泳管
.每人取电泳管1支，标好号码，玻棒堵住底部，加1—2滴40%蔗糖于底端。（与橡皮接触部分凝胶不易聚合）。
.分离胶制备：10人一组。
吸取：1号2^1
2号4ml 在桑玻氏管中混匀，用真空泵抽气至无气泡为止。
水2ml
抽气后加3号8ml,混匀备用（可灌胶12支）。
用玻璃滴管灌胶于电泳管中，高约8cm，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层（注意：不要打乱凝胶液面，切忌加入的水呈滴状坠入！），垂直静置凝胶让它进行聚合反应。聚合时可见原来加入水层出现的界面逐渐消失（因相互扩散），继又出现界面时，表明凝胶已经聚合，再静置15分钟使之聚合完全（应在30-60分钟内聚成）。
.样品液制备：
血清1-2滴
40%蔗糖 1滴 于一小试管中混匀备用
0.05%漠酚兰1滴
.待分离胶成胶后（重新出现界面15分钟）用滤纸条吸干上层覆盖水
.浓缩胶制备，10人一组。
吸取：4号 同1
*
5号2」1 在桑玻氏管中混匀，真空泵抽至无气泡为止。
6号4m1
抽气后加3号1ml,混匀备用。
.用玻璃滴管灌浓缩胶于分离胶上，高约1?1.5cm，然后小心覆盖蒸馏水高约0.5cm，垂置放置，待其成胶。
.待浓缩胶成胶后，用滤纸条吸干上层覆盖水，拔去底端玻棒塞，用滤纸条吸干蔗糖液，将胶管套在橡皮塞中，并装至电泳槽内，然后倒入下槽电泳缓冲液，并用缓冲液灌满胶管底部的空隙，排净空气（否则影响电流通过）。
9.上样：倒入上槽电泳缓冲液，用电泳缓冲液小心灌满玻管上端以排出空气。然后用微量加样器吸样品液50u1，加在浓缩胶上。
10
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